4.2.6. Особенностью растительных митохондрий является присутствие малик-энзима.

Стабильная работы ЦТК во многом зависит от концентрации промежуточных соединений, а значит и от процессов, связанных с их удалением или, наоборот, вовлечением в цикл. При этом известно, что многие интермедиаты цикла активно из него уходят и используются в различных реакциях в цитозоле (см.4. 2.8). В связи с этим важное значение имеют так называемые анаплеротическими реакции, которые катализируют взаимопревращение продуктов гликолиза и ЦТК, и при необходимости «подкармливают» цикл, пополняя пулы промежуточных соединений.

Так, ФЕП-карбоксилаза катализирует синтез оксалоацетата из ФЕП:

. ФЕП + НСО₃^- ОАА + Фн

ФЕП-карбоксилаза

Как мы уже знаем (4. 2.4), оксалоацетат может быть также синтезирован из пирувата при участии пируваткарбоксилазы:

пируват + СО₂ + АТФ ОАА + АДФ + Фн

пируваткарбоксилаза

Малатдегидрогеназа катализирует легко обратимое взаимопревращение оксалоацетата и малата:

малат + НАД⁺ ОАА + НАДН + Н⁺

НАД-зависимая малатдегидрогеназа

Особый интерес вызывает функционирование в растительной клетке малик-энзима, который катализирует окислительное декарбоксилирование малата:

малат + НАД⁺ пируват + СО₂ + НАДН

НАД- зависимый малик-энзим

СО₂

У растений малик-энзим присутствует не только в цитозоле, но и в митохондриях (НАД⁺-зависимая изоформа) и в хлоропластах (НАДФ⁺-зависимая изоформа). Наличие этого фермента в митохондриях делает возможным получать пируват из малата и тем самым обходить последнюю реакцию гликолиза (см.рис.4.5) Действительно, образованный в гликолизе ФЕП является субстратом сразу двух реакций. При участии пируваткиназы он превращается в пируват(1), а при участии ФЕП-карбоксилазы - в оксалоацетат (2). Последний легко восстанавливается до малата ( 3). Поступив в митохондрии, малат либо сразу включается в ЦТК, либо окисляется малик-энзимом до пирувата (5). На самом деле не совсем понятно, насколько этот альтернативный способ образования пирувата из малата используется in vivo в нормальной физиологической ситуации. Возможно, он включается при регуляторном подавлении активности пируваткиназы (см. 4.2.7.). Тем не менее дублирование реакций, связанных с синтезом пирувата, является проявлением пластичности растительного метаболизма и, безусловно, расширяет их адаптивные возможности. Так, трансгенные растения табака, лишенные пируваткиназы, выживали и поддерживали нормальный метаболизм за счет этого обходного пути.

4.2.7. Распад глюкозы регулируется ключевыми метаболитами и подчинен комплексной системе контроля.

В гликолизе и ЦТК действуют несколько ключевых реакций, благодаря которым весь процесс окисления глюкозы от начала до конца является контролируемым. Наиболее важной точкой контроля гликолиза являются реакции гликолиза, связанные с превращением фруктозо-6-фосфата во фруктозо-1.6. –бисфосфат и обратно. Все ферменты, участвующие в прямой и обратной реакции, подвержены аллостерической регуляции ( см. рис.4.6). В клетках животных АТФ-зависимая фосфофруктокиназа активируется АДФ и подавляется АТ, тогда как в клетках растений этот фермент активируется ионом фосфата, а ингибируется ФЕП. Обратная реакция, катализируемая фосфатазой, в том и в другом случае активируется АТФ и цитратом, и подавляется АДФ. Такая система регуляции означает, что накопление в клетке нереализованного АТФ и фосфоенолпирувата на фоне низкого уровня АДФ и Фн приведет к подавлению активности фосфофруктокиназы и активации фосфатазы, т.е. к торможению скорости распада глюкозы.

Кроме того, в регуляцию этих реакций включен еще один фактор – фруктозо-2.6.-бисфосфат, который является регуляторной молекулой у всех эукариот. Фруктозо-2.6-бисфосфат* действует как активатор прямой и ингибитор обратной реакции, т.е. стимулирует гликолиз и подавляет глюконеогенез. У животных фруктозо-2.6.-бисфосфат активирует АТФ-зависимую фосфофруктокиназу и подавляет активность фосфатазы. У растений, в отличие от животных, фруктозо-2.6-бисфосфат не действует на АТФ-зависимый фермент, но четко активирует ФФн-зависимую фосфофруктокиназу, и ингибирует фосфатазу.

2-киназа

Фруктозо-6-фосфат Фруктозо-2.6-бисфосфат

2-фосфатаза

*Фруктозо-2.6.-бисфосфат образуется и деградирует при участии двух ферментов: фруктозо-6 -фосфат 2-киназы и фруктозо- 2.6- бисфофатазы:

Активность 2-киназы активируется при накоплении фруктозо-6фосфата, и ингибируется трехуглеродными продуктами гликолиза – ФЕП и ФГА и ФГК. Таким образом, синтез самой регуляторной молекулы сложным образом зависит от соотношения С6\ С3 –сахаров в растительной клетки.

Второй регуляторный фермент гликолиза, пируваткиназа, аллостерически ингибируется метаболитами ЦТК, цитратом и малатом, и активируется АДФ и Фн.

Следующей точкой контроля на пути окисления глюкозы является ПДК, на примере которой можно видеть, как иногда сложно регулируется активность ключевых ферментов. Одним из способов «быстрого реагирования» в клетке является изменение активности ферментов за счет их обратимого фосфорилирования – дефосфорилирования при участии специальных протеинкиназ и фосфатаз. Именно такому способу регуляции подвержен и ПДК: АТФ-зависимое фосфорилирование комплекса подавляет его активность, а при отщеплении фосфатной группы активность восстанавливается (см. рис.4.7).Состояние комплекса зависит от активности киназы, которая в свою очередь подвержена аллостерической регуляции. Киназа активируется АТФ и ионом аммония и ингибируется субстратом комплекса – пируватом. Регуляторные свойства фосфатазы остаются пока неясными. Кроме того, ПДК ингибируется по типу обратной связи НАДН и ацетилСоА.

Регуляторными ферментами ЦТК являются цитратсинтаза и НАД-зависимая изоцитратдегидрогеназа. Активность цитратсинтазы аллостерически подавляется АТФ и НАДН. Изоцитратдегидрогеназа активируется АДФ и цитратом, и ингибируется АТФ и НАДН. Таким образом, ключевую роль в управлении ЦТК играет соотношение НАДН/НАД⁺ и АТФ/АДФ в матриксе митохондрий. При высоком содержании АТФ и НАДН работа цикла будет тормозиться.

Таким образом, на всем пути окисления глюкозы действуют ферменты, активность которых сложным образом зависит от многих факторов. В то же время в системе регуляции прослеживается общий принцип – ключевые реакции регулируются «снизу вверх», т.е. метаболитами, которые образуются в последующих реакциях, и, прежде всего, на заключительной стадии, когда в процессе окислительного фосфорилирования синтезируется основная масса АТФ из АДФ и Фн. Во всех случаях ключевые ферменты реагируют либо на абсолютное содержание, либо на соотношение АДФ, АТФ и Фн. Такая система регуляции очень логична и направлена на поддержание в клетке режима экономии, при котором скорость распада глюкозы соответствовала бы потребностям клетки в АТФ и других продуктах дыхания. При высоком уровне АДФ и Фн, который отражает быстрый расход в клетке синтезируемой АТФ, ключевые реакции гликолиза и ЦТК активируются, а при накоплении АТФ - тормозятся. Благодаря такой системе регуляции скорость окисления глюкозы и дыхания в целом координируется в соответствии с энергетическим статусом клетки.