Методы определения белка

1) Белки можно обнаружить по ряду характерных реакций, которые основаны на их физико-химических свойствах.

Эти качественные реакции получили название «цветные реакции на белки», т.к. они дают окрашенные соединения.

Многие цветные реакции положены в основу количественных методов определения белка.

2) Классическим методом количественного определения белка является метод Къельдаля (1883г). Он основан на определении азота в исследуемом материале и дальнейшем перечете азота на белок с помощью белковых коэффициентов.

Методика определение содержание белка по Къельдалю для некоторых видов биологического сырья, в частности для зерна и зернопродуктов, закреплена соответствующими ГОСТами.

3) Биуретовый метод.

4) Метод определения белка по Лоури.

5) Определение белка с Куммасси синим и др.

Эти методы имеют ряд преимуществ, такие как простоту, чувствительность и удобство для выполнения серийных анализов.

Но все известные в настоящие время методы определения белка сравниваются и сопоставляются с методом Къельдаля.

Выделение и очистка белка

Изучение белков любого биологического объекта начинается с их выделения и, хотя бы, частичной очистки.

1этапа выделения белков – это разрушение клеточной структуры материала.

В результате этой операции обеспечивается дальнейшее наиболее полное извлечение белков. Разрушение клеточной структуры можно проводить различными способами. Выбор того или иного способа зависит от объекта задач исследования.

Например: растирание в ступке. Для этой цели часто используются приборы – гомогенизаторы различного устройства, ультразвуковые дезинтеграторы.

При выборе разрушения клеточной структуры биологического материала надо помнить, что интенсивное механическое воздействие может вызвать денатурационные изменения в белках.

2 этап – экстракция белков (извлечение). Этот этап позволяет извлекать белки из биологического материала, т.е. переводить их в раствор.

Выбирая различные экстракты и подбирая режимы экстракции (время, температура, рН и т.п.) можно избирательно перевести в раствор разные группы белков.

Например: водой извлекаются альбумины, 10% -ным раствором хлорида натрия – глобулины, 60-80% -ным раствором этанола – проламины и слабыми щелочными растворами (0,2%-ный раствор едкого натрия) – глютелины.

Для полного извлечения белка обычно проводится трехкратная экстракция биологического материала.

3 этап – осаждение белка. Выбор способа и режима осаждения определяется поставленной задачей и индивидуальными особенностями объекта исследования.

а) Осаждение белков раствором трихлоруксусной кислоты (ТХУ) позволяет отделить белки от пептидов и аминокислот, но при этом происходит необратимая денатурация белка.

б) Осаждение белков органическими растворителями

Этот способ широко используется в промышленности при производстве ферментных препаратов. При этом подбирается определенная концентрация осадителя, обеспечивающая выделение нужной белковой фракции. Для лучшего сохранения нативной структуры исследуемых белков все операции проводят при низкой температуре(+4 ⁰С).

в) Высаливание белка. Нативная структура белков хорошо сохраняется при их осаждении сульфатом аммония (используют также соли щелочных и щелочноземельных металлов).

г) Осаждение в изоэлектрической точке.

Избирательное осаждение белков можно провести путем изменения рН белкового раствора. При таком способе осаждения обычно сохраняется нативная структура белков, как в осадке, так и в надосадочной жидкости.

д) Осаждение путем тепловой коагуляции

Осаждение белков можно проводить, варьируя тепловую обработку белкового экстракта. При этом, в первую очередь, выпадают в осадок более лабильные белки, а термостабильные белки остаются в растворе.

Пример: отделить - амилазу от - амилазы можно путем нагревания солодовой вытяжки до 78 ⁰С. При такой температуре - амилаза инактивируется, а - амилаза сохраняет свою активность.

4 этап – очистка белков. Если в дальнейшем необходимо получить белковый препарат более высокой степени чистоты, то применяют методы фракционирования, основанные на различных физико-химических свойствах индивидуальных белков.

а) Метод гель-фильтрации (метод молекулярных сит).

Этот метод был разработан в 1959 году. С его помощью проводят разделение веществ по молекулярной массе. В качестве геля применяют препараты сефадексов.

Через колону, заполненную набухшим сефадексом, пропускают исследуемый белковый раствор.

Белки, молекулы которых по своим размерам превосходят размеры ячеек в гранулах сефадекса, не могут проникнуть внутрь гранул и свободно проходят между частицами геля. Белки небольшой молекулярной массы частично проникают в гранулы сефадекса и распределяются в большем объеме и движутся по колонке с меньшей скоростью. Поэтому высокомолекулярные белки выходят из колонки раньше низкомолекулярных.

б) Электрофоретическое разделение белков.

Электрофорез – физический процесс разделения белков в электрическом поле постоянного тока.

Белковые молекулы, как амфотерные соединения, в буферных растворах несут заряды разные по величине и знаку. В электрическом поле постоянного тока белки движутся к аноду или катоду в зависимости от знака своего заряда. Скорость такого движения определяется величиной заряда.

Варианты электрофоретического разделения белков классифицируются в зависимости от типа электрической системы, типа носителя, конструкции аппаратуры и способа обнаружения разделяемых белковых фракций.

в) Изоэлектрическое фокусирование белков.

Принцип этого методы основан на разделении белков, имеющих разные изоэлектрические точки. Метод был разработан в Швеции в 60-х годах.

Изоэлектрическое фокусирование белков осуществляется в процессе их электрофоретического разделения на колонке, по высоте которой создается градиент рН.

Белок движется под воздействием электрического поля, пока не достигнет той области колонки, где рН соответствует изоэлектрической точке данного белка. Суммарный электрический заряд белка становится равным нулю, белок теряется в этой области подвижность и концентрируется в виде узкой зоны.

Молекулы разных белков фокусируются в разных частях колонки узкими зонами, при рН, соответствующих их изоэлектрическим точкам.

г) Аффинная хроматография(хроматография по сродству).

Аффинная хроматография основана на способности биологически активных белков специфически и обратимо связываться с другими веществами, называемыми лигандами.

Через колону, заполненную сорбентом (лигандом), пропускают смесь беков. Все белки, не обнаруживающие сродства к данному лиганду, например, субстрату фермента, свободно проходят через колонку, не задерживаясь, и только белок, который имеет сродство к данному лиганду будет адсорбироваться на колонке.

В настоящее время этот метод широко применяется для выделения в нативном состоянии ферментов, их белковых ингибиторов и других белков.