Вопрос 3.

Описать принципы микроскопии с использованием фазово-котрастного микроскопа.

Метод фазового контраста предназначен для получения изображений прозрачных и бесцветных объектов, невидимых при наблюдении по методу светлого поля.

Суть метода в том, что даже при очень малых различиях в показателях преломления разных элементов препарата световая волна, проходящая через них, претерпевает разные изменения по фазе (приобретает т. н. фазовый рельеф). Иными словами, в получаемом видимом изображении распределение яркостей (амплитуд) воспроизводит фазовый рельеф. Получаемое таким образом изображение называется фазово-контрастным. Фазово-контрастное устройство может быть установлено на любом световом микроскопе и состоит из:

Набора объективов со специальными фазовым пластинками; Конденсора с поворачивающимся диском. В нем установлены кольцевые диафрагмы, соответствующие фазовым пластинкам в каждом из объективов; Вспомогательного телескопа для настройки фазового контраста.

Настройка фазового контраста заключается в следующем:

1. Заменяют объективы и конденсор микроскопа на фазовые (обозначенные буквами Ph);

2. Устанавливают объектив малого увеличения. Отверстие в диске конденсора должно быть без кольцевой диафрагмы (обозначенной цифрой "О");

3. Настраивают свет по Келеру;

4. Выбирают фазовый объектив соответствующего увеличения и фокусируют его на препарат;

5. Поворачивают диск конденсора и устанавливают соответствующую объективу кольцевую диафрагму;

6. Вынимают из тубуса окуляр и вставляют на его место вспомогательный телескоп. Настраивают его так, чтобы были резко видны фазовая пластинка (в виде темного кольца) и кольцевая диафрагма (в виде светлого кольца того же диаметра). С помощью регулировочных винтов на конденсоре совмещают эти кольца. Вынимают вспомогательный телескоп и вновь устанавливают окуляр.

Благодаря применению этого способа микроскопии контраст живых неокрашенных микроорганизмов резко увеличивается и они выглядят темными на светлом фоне (позитивный фазовый контраст) или светлыми на темном фоне (негативный фазовый контраст).

Фазово-контрастная микроскопия применяется также для изучения клеток культуры ткани, наблюдения действия различных вирусов на клетки и т. п.

Вопрос 4.

Принципы микроскопии с использованием темнопольного микроскопа.

Темнопольная микроскопия(темновая) - используется за наблюдением за движением бактерий. Применяется боковое освещение - получается светящийся объект на тёмном фоне (бактерии - плотные частицы отражают боковой свет).

Стёкла должны быть очень чистыми и определённой толщины (предметные - не более 1,2 мм, покровные - 0,17 мм).

Готовят препараты по типу «раздавленная капля» или «висячая капля». Настройка темнопольного освещения:

1. устанавливают свет по Келеру;

2. заменяют светлопольный конденсор темнопольным;

3. на верхнюю линзу конденсора наносят иммерсионное масло или дистиллированную воду;

4. поднимают конденсор до соприкосновения с нижней поверхностью предметного стекла;

5. объектив малого увеличения фокусируют на препарат;

6. с помощью центрировочных винтов переводят в центр поля зрения светлое пятно (иногда имеющее затемненный центральный участок);

7. поднимая и опуская конденсор, добиваются исчезновения затемненного центрального участка и получения равномерно освещенного светлого пятна. Если этого сделать не удается, то надо проверить толщину предметного стекла (обычно такое явление наблюдается при использовании слишком толстых предметных стекол - конус света фокусируется в толще стекла). После правильной настройки света устанавливают объектив нужного увеличения и исследуют препарат.

Метод приготовления препарата для темнопольной микроскопии,фазово- контрасной и люминесцентной:

Готовят нативный препарат ( раздавленная капля)

Микроскопируют с объективом 40х или специальным иммерсионным объективом. Толщина предметных стекол не должна превышать 1-1.5 мм, покровных - 0.15-0.20 мм Для люминесцентной микроскопии препарат окрашивают специальными флуоресцентными красителями: акридиновым желтым, акридиновым оранжевым, ауромином, корифосфином.

При работе с иммерсионным объективом используют нефлюоресцирующее масло.