Использование культуы клеток и тканей растений в практике

Клониальное микроразмножение растений

• Культивирование клеток растений относительно несложно , среды просты и дёшевы , а культура клеток неприхотлива

• Метод культуры клеток растений состоит в том , что отдельная клетка или ткань , помещённая в питательную среду начинает размножаться , образуя первоначально недифференцированную ткань –каллус , которая при переносе в более сложную питательную среду ( селективную ) даёт целое жизнеспособное растение , пригодное для посадки ( получаемые зародши растений стерильны , что позволяет при размножении ими культурных растений добиваться увеличения их продуктивности до 30 % , теряемых за счёт поражения традиционного посадочного материала спорами грибов , микроорганизмами вирусами и проч . )

• Если необходимо , например , получить солеустойчивые растения , то составляется специальная питательная среда с повышенным содержанием солей в которые высеваются тысячи растительных клеток , большинство из которых гибнет , но отдельные выживают в силу случайных наследственных изменений и из них могут впоследствии регенерировать целые , уже солеустойчивые растения ( это пример селекции на клеточном уровне , когда отбор производится не на целых растениях , а на тысячах отдельных клетках в одной чашке Петри , во много раз повышает возможности отбора )

• Вегетативное размножение на искусственных питательных средах позволяет почти бесконечно размножать одно растение из маленьких кусочков вегетативных органов ( овощные , плодовые и декоративные культуры )

• Метод культуры тканей даёт возможость получить гаплоидные растения из пыльцевыз зёрен или яйцеклеток ( такие растения не способны образовывать гамет , однако при обработке их колхицином получаются диплоидные плодовитые растения , являющиеся чистыми линиями гомозоготными по всем без исключения генам ; такой способ позволяет получить чистые линии всего за несколько месяцев вместо нескольких лет – более 10 - при традиционном способе путём их инбридинга ) , что является новей шим методом селекции растений

• Растения , развивающиеся из одной клетки , генетически не стабильны , что связано с мутациями их хромосом ; генетическая нестабильность даёт разнообразные формы растений в качестве исходного материала для селекции

• Целое растение можно получить и из протопластов растительных клеток , под которыми понимают клетки , у которых искусственно с помощью гидролитических ферментов ( пектиназы и целлюлазы ) удалена целлюлозно-пектиновая клеточная стенка , а содержимое клетки остаётся покрытолишь плазматической мембраной ( протопласты получают из клеток листьев , корней , лепестков , пылцы , плодов и др. )

• Получение растений из одной клетки или протопласта называют клониальным микроразмножением ; оно позволяет резко сократить сроки размножения многих видов растений и быстро получить одно и то же растение в сотнях тысяч экземпляров в качестве посадочного материала , незаражённого возбудителями болезней ( данный метод позволяет из небольшой части растения - верхушки побегов , листа , стебля – получать до 1 млн. растений в год , что особенно важно при размножении генетически уникальных , редких , лекарственных форм , а также хозяйственно ценных и вновь полученных сортов ; при этом посадочный материал свободен от грибковых , бактериальных и вирусных инфекций )

• В искусственных условиях выращиваются клетки лекарственных растений , способные к биосинтезу ценных медицинских веществ ( тонизирующих жень-шеня, антисклеротических , стероидных и др. ) ресурсы дикорастущих растений исчезают или истощаются , а потребность в них увеличивается ; производство веществ на основе культивируемых клеток растений не требует посевных площадей , не зависит от сезонных и климатических факторов , совершенно безвредно для окружающей среды

Гибридизация соматических клеток ( соматическая гибридизация ) у растений

• Протопласты растительных клеток без жёстких клеточных стенок могут сливаться друг с другом , образуя гибридную клетку , обладающую признаками обоих родителей

• Даёт возможность получать гибриды между организмами любых видов , родов и даже семейств, которые не возникают естественным путём из-за барьера нескрещиваемости ( так были получены гибриды табака и картофеля, рапса и турнепса , табака и белладонны , картофеля и томата , яблоко-лук )

• Полученные гибридные протопласты объединяют ценные признаки растений разных видов и могут обладать ценными качествами ( устойчивостью к заболеваниям и неблагоприятным условиям среды повышенным содержанием ценных веществ , высокой продуктивностью и т. д. и стать основой новых сортов и форм ( решить эту проблему традиционными методами селекции практически невозможно )

Этапы соматической гибридизации :

1. Получение и слияние протопластов клеток разных видов , родов , семейств

2. Культивирование гибридных протопластов в селективных питательных средах

3. Регенерация целых гибридных растений из гибридных протопластов через образование последними каллуса

• Протопласты , сливаясь друг с другом захватывают из питательной среды различные молекулы и даже частицы ; это свойство используется для введения в протопласт чужеродной ДНК или клеточных органелл ( ядра , хлоропластов , митохондрий , хромосом ) с целью получения гибридных клеток с другим генетическим материалом ; созданные таким образом клетки можно использовать в других областях биотехнологиии ( генной инженерии , селекции )

Клеточная инженерия у животных

Метод гормональной суперовуляции и трансплантации эмбрионов

• Выделение от лучших коров десятков яйцеклеток в год способом гормональной индуктивной полиовуляции ( вызывается одновременное созревание сразу до 20 яйцеклеток ) , которые искусственно оплодотворяются в яйцеводе или in vitro , а получающиеся эмбрионы на 7 день вымываются из матки и трансплантируют в матки другим коровам - приёмным матерям ( коровы , имеющие более низкую племенную ценность ) для дальнейшего развития , которые дают жизнь телятам –-близнецам , что позволяет получить в течение года целые стада племенных животных и повысить продуктивность породы ( предварительно создаются большие запасы замороженной спермы от выдающихся быков производителей , позволяющие получать от них потомство в течение многих лет после их смерти )

• Созданы банки замороженных , искусственно оплодотворённых эмбрионов высокопородных животных для дальнейшей пресадки их приёмным матерям

Получение трансгенных животных

• Введение в яйцеклетки исходных животных чужих ДНК ( рекомбинантную плазмиду ) ; животные , развившиеся из таких оплодотворённых яйцеклеток будут содержать в одной из своих хромосом копию введённого гена и передавать его по наследству , продуцируя белок , закодированный этим геном ( известен способ передачи гена гормона роста от крыс в яйцеклетки мышей )

• Возможно получение трансгенных животных способом комбинирования бластомеров овцы с бластомерами козы , что привело к появлению гибридных животных ( ковец )

• Эти эксперименты показывают возможность преодоления видовой несовместимости на самых ранних этапах развития ( в перспективе возможно в течение года получение хозяйственно-ценных гибридов с заданными свойствами , которые невозможно получить путём скрещиваний )

Гибридизация соматических клеток у животных

• Соматические клетки содержат весь объём генетической информации

• Соматические клетки для культивирования и последующей гибридизации у человека получают из кожи , костного мозга , клеток крови ( лимфоциты ) , тканей эмбрионов , соединительной ткани

• При выращивании двух клеточных линий в одной питательной среде происходит их спонтанное слияние с образованием гибридных клеток , содержащих в общей цитоплазме ядра обеих родительских клеток – гетерокарионов ; гетерокарионы размножаются путём деления ( митоза )

• После митоза и последующего разделения цитоплазмы их двухядерного гетерокариона образуются две одноядерные клетки – синкарионы – настоящие гибридные клетки , имеющие хромосомы обоих родительских клеток

• При дальнейшем размножении синкарионов происходит постепенная элиминация ( гибель ) хромосом того организма , клетки которого имеют более медленный темп размножения

• Гибридизация соматических клеиок производится не только между разными видами , но и типами : человек х мышь , человек х комар , мышь х курица ( например , гибридные клетки человека и мыши имеют 43 пары хромосом : 23 от человека и 20 от мыши )

• В эксперименте возможна пересадка ядер соматических клеток в яйцеклетки , искусственно лишённые ядер ; так была открыта способность клеточных ядер обеспечить нормаьное развитие яйцеклеток

Получение моноклониальных антител

• В ответ на введение антигена ( бактерии , вирусы , эритроциты и др. ) органимизм продуцирует с помощью В – лимфоцитов специфические антитела , которые представляют собой белки , называемые иммуноглобулинами ,обуславивающие защитные реакции организма по механизму гуморального иммунитета ; однако любое чужеродное тело , попадающее в организм , представляет собой смесь разных антигенов которые возбуждают продукцию разных антител ( для практических потребностей – диагностики и лечения ряда болезней - необходимы моноспецифические сыворотки , содержащие антитела только одного типа – моноклониальные антитела , поражающие определённые антигены )

• Антителообразующие клетки ( В – лимфоциты ) не могут расти и размножаться вне организма на питательной среде ; в то же время существуют злокачественные ( раковые ) опухоли костного мозга – миеломы , клетки которых с огромной скоростью размножаются на питательных средах в течение длительного времени ; задача заключается в создании гибридных клеток , совмещающих особенности В-лимфоцитов к образованию специфических антител и раковых клеток – быстро размножающихся в искусственных питательных средах

• Созданием искусственных гибридов антител занимается новая ветвь биотехнологии – иммунобиотехнология

Технология получения моноклониальных антител

1. Иммунизация мышей или крыс , т. е. заражение их желаемым антигеном ( обычно за 5 дней до гибридизации ) , приводящая к началу продукции лимфоцитами специфических антител одного вида ( моноклониальных )

2. Получение гибридных клеток в результате слияния раковых клеток миеломы с антителообразующими лимфоцитами мышей ( полученный гибрид этих клеток называется гибридома ), способных , как и все опухолевые клетки , бесконечно долго размножаться на искусственных питательных средах, давая многочисленную популяцию гибридом - гибридомный клон ; клетки возникшего клона способны также продуцировать неограниченное количество антител одного типа ( моноклониальных )

• Клонирование позволяет вырастить из одной клетки гибридомы жизнеспособную популяцию , которая продуцирует антитела , заданной иммунизацией специфичности ( для сохранения клона его клетки хранят неограниченное время в жидком азоте при – 180^о )

• Метод гибридомной технологии широко используется в биологии и медицине для диагностики и лечения ряда болезней , продукции ферментов , вакцин и лечебных сывороток ; в 1984 г . Келлеру и Мильштейну ( англ. ) была присуждена Нобелевская премия

• В1980 году получены человеческие гибридомы , продуцирующие моноклониальные антитела к антигенам вируса крови

• Возможно слияние трёх или четырёх клеток в единый гибрид с образованием триом или квадром , способных к продукции бифункциональных моноклониальных антител, т. е. к связыванию двух разных антигенов ; такие бифункциональные антитела используют для направленного транспорта : лекарственные препараты , гормоны , ингибиторы роста идут к определёному месту где требуется блокировать антиген

Клеточная инженерия у человека

• Открыта и широко используется возможность оплодотворения яйцеклеток человека сперматозоидами в пробирке и дальнейшее развитие образованных таким образом зародышей при имплантации их в матку матери

• В 1993 году разработана методика получения монозиготных близнецов человека in vitro , путём разделения эмбрионов на бластомеры и доращивания последних до 32 клеток , после чего они могли быть имплантированы в матку женщины