Лабораторный практикум работа 1. Определение численности микроорганизмов различных физиологических групп в почве

1. Приготовление плотных и жидких питательных сред для выявления разных физиологических групп микроорганизмов

Ход работы

Для учета численности микроорганизмов в почве широко применяют метод питательных пластин (метод Коха). При этом почвенную суспензию засевают на плотных средах. Этот метод позволяет учесть живые клетки в почве и выявить их родовой, иногда видовой состав, а также чистые культуры бактерий. Однако в связи с тем, что питание у разных групп микроорганизмов специфично, нельзя составить универсальную питательную среду, на которой развивались бы все физиологические группы микроорганизмов, поэтому учет ведется на средах, предназначенных для разных физиологических групп микроорганизмов. При посеве почвенной суспензии на жидких средах по методу предельных разведений обычно обнаруживается меньшее количество микробных клеток, но метод удобен для выявления многообразия групп микроорганизмов.

Сапрофитные микроорганизмы, использующие органические формы азота, выявляют на мясопептонном агаре (МПА).

Микроорганизмы (особенно актиномицеты), способные использовать минеральные формы азота, выявляют на крахмало-аммиачном агаре (КАА). Среда содержит (в г/л воды): крахмал растворимый – 10; (NH₄)₂SO₄ – 2; K₂HPO₄ – 1; MgSO₄ – 1; NaCl – 1; CaCO₃ – 3; агар – 20. Крахмал предварительно растворяют в небольшом количестве воды и приливают к остальной среде.

Аэробные целлюлозоразрушающие микроорганизмы учитывают на среде Имшенецкого и Солонцовой, содержащей (в %): NaNO₃ – 0,25; K₂HPO₄ – 0,4; MgSO₄ – 0,03; NaCl – 0,1; CaCl₂ – 0,01; CaCO₃ – 0,5.

По 5 мл среды разливают в пробирки, а в качестве источника углерода опускают полоску фильтровальной бумаги (длиной 7-10 см), не содержащей крахмала (реакция J₂ с KJ). Полоска на 4-5 см должна выступать над средой.

Денитрифицирующие бактерии учитываются на среде Гильтая или на более простой среде следующего состава (в г/л дистиллированной воды): сегнетова соль – 20; KNO₃ – 2; K₂HPO₄ – 0,5; MgSO₄ – 0,2; FeSO₄ – следы.

Анаэробные азотофиксаторы (Clostridium pasteurianum) учитывают на среде Виноградского следующего состава (в г/л дистиллированной воды): глюкоза – 20; K₂HPO₄ – 1; CaCO₃ – 5; MgSO₄ – 0,5; NaCl – 0,5; FeSO₄ и MnSO₄ – следы.

Среду разливают по 9 мл в пробирки (половина пробирки). Перед стерилизацией в нее опускают вверх дном поплавок – небольшую пробирку (0,5Х3-4 см) для улавливания газов.

2. Выявление групп микроорганизмов методом обрастания комочков почвы

Аэробные целлюлозоразрушающие микроорганизмы. Для учета используют гелевые пластины или пластины голодного агара. На платину помещают круг стерильной фильтровальной бумаги, пропитанной средой Виноградского или средой Гетчинсона, содержащей (в г на 200 мл дистиллированной воды): NaNO₃ –2,5; K₂HPO₄ – 1; MgSO₄ – 0,3; NaCl – 0,1; CaCl₂ – 0,1; FeCl₃ – 0,01.

Азотобактер выявляют на гелевых платинах, пропитанных 3-5 мл среды Виноградского, следующего состава: (в г на 200 мл воды): манит – 20; K₂HPO₄ – 1; MgSO₄ – 0,5; NaCl – 0,5; CaCO₃ – 5; FeSO₄ и MnSO₄ – по 0,01; смесь микроэлементов по Федорову – 1 мл.

Смесь микроэлементов по Федорову содержит (в г/л дистиллированной воды): H₃BO₃ и (NH₄)₂MoO₄ – по 5; KJ и NaBr – по 0,5; ZnSO₄ – 0,2; Al₂(SO₄)₃ – 0,3.

После упаривания среды до исчезновения избыточной влаги на поверхность геля раскладывают по трафарету 50 комочков почвы. Чашки помещают во влажную камеру в термостат при температуре 28-30⁰С. На 5-7-е сутки комочки почвы обрастают слизистыми колониями азотобактера.