Материалы и оборудование

1) реактивы:

Раствор 1: растворить в воде и довести до 500 мл NaNО₃ - 10,0 г, К₂НРО₄ - 2,4г, КН₂РО₄ - 1,2 г и дрожжевого экстракта -1,0 г.

Раствор 2: растворить в воде и довести до 500 мл NaNО₃ - 10,0 г, К₂НРО₄ - 2,4г, КН₂РО₄ - 1,2 г.

Раствор 3 (раствор глюкозы): растворить в воде и довести до 500мл 40,0 г глюкозы (С₆Н₁₂О₆*H₂0).

Раствор 4: растворить в воде и довести до 1000 мл MgSО₄ *7Н₂О – 4,0 г; цитрата железа (Ш) – 0,01 г.

Плотная питательная среда для поддержания культуры (скошенный агар): растворить 18 г агар-агара в воде при нагревании, добавить 50 мл раствора 1, 125 мл раствора 3, 100 мл раствора 4 и довести до 1000 мл водой. Разлить по пробиркам по 6 мл, закрыть ватными пробками и стерилизовать в автоклаве. После автоклавирования остудить в наклонном положении для приготовления скошенного агара.

Стерильная вода.

Растворы 1,2,4, скошенный агар и воду автоклавировать при 1,0 атм. 30 мин, раствор 3 при 0,5 атм. 30 мин. Хранить не более 2 недель при температуре 2-4⁰С.

2) оборудование: колбы на 250 мл с ватными пробками стерильные, пипетки на 1,5 и 10 мл стерильные, цилиндры на 100 мл стерильные. Посуда стерилизуется 1 час при 180⁰С или 2 часа при 160⁰С в сухожаровом шкафу.

Работа 9. Определение общей микробной биомассы в почве

Метод основан на определении различия в количестве растворимого органического углерода в почвенных образцах, подвергнутых фумигации и не фумигированных образцах. При фумигировании почвенных образцов живые клетки микроорганизмов погибают и минерализуются, увеличивая тем самым содержание растворимого органического углерода. Органический углерод экстрагируют раствором сульфата калия и определяют при окислении бихроматом калия.

Ход работы

1. Фумигация образцов

Взвесить 150-200г влажной почвы в четыре стеклянных стаканчика.

Два стаканчика поместить в десикатор. Туда же поместить стеклянный стаканчик с 50 мл безэтанолъного хлороформа и гранулами против сильного кипения. Удалить из десикатора воздух с помощью масляного насоса до того момента, пока хлороформ не закипит, и перекрыть кран десикатора. Через 24 часа фумигации при комнатной температуре в темноте удалить хлороформ из десикатора и вынуть образцы. С двумя остальными образцами осуществляют ту же процедуру, но без хлороформа.

2. Получение почвенного экстракта

Смешать 1 часть фумигированного (или не фумигированного) образца с 5 частями раствора сульфата калия, перемешать на ротаторе 30 мин. и отфильтровать (каждый образец в трех повторностях). В полученном почвенном экстракте определить содержание органического углерода.

3. Определение органического углерода в почвенном экстракте

В круглодонной колбе смешать 5-20 мл почвенного экстракта с 10 мл раствора бихромата калия и с 10 мл серной кислоты. Закрыть колбу воронкой и кипятить 30 мин. при температуре 150⁰С. Охладить колбу до комнатной температуры. Добавить 100 мл дистиллированной воды, 1-2 капли раствора индикатора и титровать раствором соли Мора до перехода окраски от сине-фиолетового до изумрудно-зеленого. Аналогичную процедуру проводят с контролем на реагенты (вместо почвенного экстракта добавляется чистый раствор сульфата калия).

4. Расчет содержания растворимого органического углерода

Расчет содержания растворимого органического углерода осуществляют по формуле:

С_орг, мг/г = ((КР – Ф или НФ)*0,3*V*100) / (мл*а*%св), где

КР - средний объем соли Мора, затраченный на титрование контроля

на реактивы, мл;

Ф - средний объем соли Мора, затраченный на титрование

фумигированного образца, мл;

НФ - средний объем соли Мора, затраченный на титрование

нефумигированного образца, мл;

0,3 - пересчетный коэффициент (1 мл 0,1 М (NН₄)₂FeSО₄^.6H₂0

соответствует 0,3 мг С);

V - объем полученного почвенного экстракт, мл;

мл - аликвота почвенного экстракта, взятого для анализа;

а - исходный вес почвы, взятый для получения экстракта, г;

100 (%св)^-l- фактор для пересчета на сухое вещество почвы.

5. Расчет количества углерода микробной биомассы

Расчет количества углерода микробной биомассы производят по формуле:

Смикр, мг С/г = (Соргфум – Соргнефум) / 0,35, где

Соргфум - среднее значение количества растворимого углерода в

фумигированном образце, мг/г;

Соргнефум - среднее значение количества растворимого углерода в

нефумигированном образце, мг/г;

0,35 - пересчетный коэффициент (от количества органического

углерода к количеству углерода микробной биомассы).