Материалы и оборудование

1. Питательные среды в колбах (МПА и КАА);

2. Жидкие среды в пробирках: среда для аэробных целлюлозоразрушающих бактерий, среда для анаэробных азотфиксаторов (Clostridium pasteurianum);

3. Гелевые пластины, пропитанные средой для аэробных целлюлозоразрушающих бактерий;

4. Стерильные чашки Петри;

5. Колбы со стерильной водопроводной водой по 90 мл;

6. Стерильные моровские пипетки на 10 мл;

7. Стерильные градуированные пипетки на 1 мл;

8. Стерильные шпатели Дригальского;

9. Часовые стекла;

10. Стеклянные палочки с оттянутыми концами;

11. Свежие почвенные пробы (почвы разных типов);

12. Чайные ложки, пинцеты, трафареты, счетная камера Вольфюгеля, лупы, микроскопы, предметные и покровные стекла, все необходимое для приготовления препаратов и микроскопирования

Работа 2. Исследование реакции микроорганизмов на факторы внешней среды

Цель работы – изучить на примере доминирующих микроорганизмов, выделенных из почвы в чистую культуру, их отношение к различным факторам внешней среды: рН, температуре, аэрации (определить осмотическую активность, чувствительность к антибиотикам и др.).

Определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам

Для определения чувствительности микроорганизмов к химиотерапевтическим препаратам в настоящее время рекомендуют методы диффузии в агар с применением бумажных дисков и метод серийных разведений в двух модификациях (на плотной и жидкой питательных средах).

Важным условием при определении чувствительности является строгое соблюдение методики проведения опытов. Состав питательной среды, возраст культуры и ее посевная доза, толщина слоя агара, влажность среды, скорость диффузии антибиотиков в среду и т. д. могут значительно повлиять на результат определения чувствительности.

Метод диффузии. Метод основан на диффузии антибиотика из небольшого фокуса (лунка в агаре, стандартный диск из фильтровальной бумаги, пропитанный антибиотиком) в плотную питательную среду, обычно агар в чашке Петри.

Метод диффузии в агар антибиотика из лунок или цилиндров значительно сложнее, чем использование дисков.

Наиболее приемлемым считается метод с использованием дисков из фильтровальной бумаги, помещенных на поверхность зараженной среды в чашке Петри. Этот метод требует наименьшего труда и дает достаточно точные результаты. Количество любого антибиотика в дисках зависит от абсолютной активности препарата, скорости, с которой антибиотик диффундирует в среду, концентрации. Содержание большинства антибиотиков в диске колеблется от 1 до 50 мкг. На практике рекомендуют пользоваться стандартными дисками, выпускаемыми нашей промышленностью.

Ход работы

Определение чувствительности проводится на одной из следующих питательных сред:

1. среда на отваре Хоттингера с содержанием 120-140 мг% аммонийного азота, 1-2% агара и значением рН 7,2-7,4;

2. казеиново-дрожжевая среда с таким же содержанием аммонийного азота, агара и значением рН;

3. мясопептонная среда с таким же содержанием аммонийного азота, агара и значением рН.

Допускается добавление в среду 5% крови или сыворотки, что не оказывает отрицательного влияния на результаты анализа.

Для проведения анализа на чувствительность в стерильные чашки Петри разливают по 20 мл одной из вышеуказанных питательных сред. Перед исследованием чашки. Затем на поверхность агара засевают суспензию суточной агаровой культуры исследуемого микроорганизма в сахарном бульоне (1 млрд. микробных клеток на 1 мл по оптическому стандарту). Покачиванием чашки культуру равномерно распределяют по поверхности среды, а ее излишек отсасывают пастеровской пипеткой. На поверхность агара пинцетом накладывают диски с различными анти­бактериальными препаратами (до 5-6). Чашки выдерживают 30 мин при комнатной температуре (период преддиффузии препаратов в агар). Затем чашки помещают в термостат при 37⁰ на 16-18 ч. Во избежание размывания зон задержки роста конденсационной водой чашки ставят вверх дном.

Диаметр зон задержки роста микроорганизмов измеряют вокруг дисков с антибиотиками, включая диаметр самого диска. Единичные колонии и рост микроорганизмов в виде тонкой пленки внутри зоны задержки роста не учитывают. Отсутствие зоны задержки роста указывает на то, что исследуемый штамм устойчив к данному препарату. Зоны диаметром до 10 мм указывают на малую чувствительность, диаметром более 10 мм - на высокую чувствительность микроорганизма.

В отчете диаметр зоны подавления роста не указывается, а отмечается, какой чувствительностью обладает исследуемая культура.