4. Определение активности уреазы в почве

К ферментам, участвующим в превращении белковых веществ, относится уреаза. Образовавшийся в результате уреазной реакции аммиак служит источником питания растений. Уреаза катализирует распад мочевины на аммиак и углекислоту. Фермент обладает строгой специфичностью действия: расщепляет только мочевину и не действует на производные. Оптимум рН уреазы близок к 7,0, но может смещаться в зависимости от концентрации мочевины, от природы и концентрации применяемых буферов. В почве уреаза может действовать в сравнительно широком диапазоне рН.

Ход работы

К 2 г почвы добавляют 5 мл фосфатного буфера (рН 6,7) и 5 мл 10 %-ного раствора мочевины. После этого колбы тщательно встряхивают и инкубируют 3 часа при 30°С. После добавляют 7,5 мл КСl, перемешивают и центрифугируют 10 мин при 3000 об/мин. Центрифугат сливают в пробирки. Далее по 1 мл центрифугата переносят в мерные колбы на 25 мл, добавляют в колбы воду (5–7 мл), тщательно перемешивают и снова добавляют небольшой объем воды, после чего вливают 1 мл раствора Неслера и 1 мл 50 %-ного раствора сегнетовой соли. Доводят до метки осторожным приливанием небольших объемов воды при тщательном перемешивании. Оптическую плотность измеряют при длине волны 480 нм в кюветах шириной 20 мм.

Активность уреазы выражается в миллиграммах NН₃ на 1 г почвы за час и рассчитывается по формуле:

NH₃ = (a −b) * p *10 / H, где

a — количество аммиака в пробе по графику, мг;

b — количество аммиака в контроле по графику, мг;

p — разведение;

H — навеска почвы, г.

Материалы и оборудование

Для определения каталазы:

1) реактивы: 30 %-ный раствор перекиси водорода, СаСО₃.

2) оборудование: колба 100 мл, пинцет, стеклянный стакан, прибор для определения активности каталазы, секундомер.

Для определения дегидрогеназы:

1) реактивы: 0,1 М раствор глюкозы, 1%-ный раствор 2,3,5-трифенилтетразолия хлористого (ТТХ), трифенилформазан, СаСО₃, этиловый спирт.

2) оборудование: фотоэлектрокалориметр, мерные колбы, пробирки, анаэростат.

Для определения инвертазы:

1) реактивы: 5 %-ный р-р сахарозы, ацетатный буфер (рН 4,7), толуол, раствор Фелинга (раствор а — 40 г сернокислой меди (CuSO4.5H2O) растворяют в дистиллированной воде и доводят до 1 л; раствор б — 200 г сегнетовой соли (C4H4O6KNa.4H2O) растворяют в дистиллированной воде, прибавляют 150 г КОН или NаОН и доводят до 1 л. Оба раствора фильтруют. Перед употреблением растворы а и б смешивают в соотношении 1:1), раствор окисного железа (86 г соли железоаммиачных квасцов (Fe2(NH4)SO4.2H2O), заливают 200 г конц. серной кислоты и доводят объем водой до 1 л), 0,1 н титрованный раствор KMnO4.

2) оборудование: мерные колбы на 50, 100 мл, колбы Бунзена, фильтр №4, водоструйный насос.

Для определения уреазы:

1) реактивы: фосфатный буфер (рН 6,7); 10 %-ный раствор мочевины; 1 н КСl; реактив Неслера; раствор сегнетовой соли (калий-натрий виннокислый: 50 г соли растворить в 100 мл дистиллированной воды); стандартный раствор: 0,1 мг NН₃ в 1 мл воды.

2) оборудование: фотоэлектрокалориметр, центрифуга.