10.8. Методы определения чувствительности к антибиотикам

Существует несколько стандартных тестов, определяющих чув­ствительность бактерий к химиотерапевтическим препаратам. Вы­явлена четкая корреляция между данными, полученными in vitro, и действием препарата in /vivo. Установлено, что для проявления удовлетворительного терапевтического эффекта концентрация препарата в сыворотке должна в 2...4 раза превышать его мини­мальную ингибирующую концентрацию (МИК).

Диффузный метод. Этот метод несколько менее чувствителен, чем метод стандартных разведений, но проще. На практике при­меняют чаще. Следует учитывать, что скорость диффузии в агаре любого препарата зависит от его структуры, молекулярной массы, наличия примесей, состава и рН среды.

1. Метод дисков. Повсеместно применяют модифика­цию, предложенную Кирби и Бауэром, признанную стандартным тестом. После посева тест-культуры на поверхность агара в чашках размещают диски из фильтровальной бумаги, пропитанные раз­личными антимикробными препаратами (используют коммерчес-

64

кие образцы, содержащие определенные концентрации). После инкубации при 37 °С в течение времени, необходимого для роста выделенного возбудителя, измеряют диаметр зоны торможения роста и сравнивают с величинами зон задержки роста, указанны­ми в инструкциях, прилагаемых к дискам. На основании сравне­ния выделенные микроорганизмы относят к чувствительным, умеренно чувствительным или резистентным.

Прежде чем предложить к реализации любой антибактериаль­ный препарат, производитель обязан определить спектр его ак­тивности по отношению к тысячам штаммов различных микро­организмов, учитывая, что фармакокинетические свойства со­единения должны обеспечивать поддержание концентраций в сыворотке в 2...4 раза превышающие МИК, в течение длительно­го времени. Учитывая имеющуюся информацию по средним по­казателям чувствительности, в большинстве лабораторий при выделении конкретных возбудителей используют определенные наборы дисков.

2. Исходный метод. Чашки Петри (желательно со шли­фованным дном) заполняют питательной средой (МПА, среда АГВ или любой другой агар, соответствующий питательным по­требностям возбудителя, например кровяной) слоем в 4...5 мм. После застывания агар подсушивают в термостате при 37 "С в те­чение 20 мин. Посев тест-культуры можно осуществлять внесени­ем в смеси с полуостывшим агаром (20⁷ клеток/мл); чаще на агар наслаивают микробную взвесь (10⁵ клеток/мл). После равномер­ного распределения по поверхности излишки суспензии удаляют, а чашки подсушивают в термостате. В агаре пробивают лунки и в каждую вносят по 0,1 мл раствора исследуемого препарата, после чего инкубируют 18 ч при 37 °С (срок инкубации можно варьиро­вать в зависимости от скорости роста микроорганизмов). Измеря­ют диаметр зоны подавления роста для каждого препарата.

Метод серийных разведений в жидких средах. Этот метод позво­ляет установить МИК и минимальную бактерицидную концент­рацию (МБК) препарата для выделенного возбудителя. Исследо­вание можно выполнять в различных объемах питательной сре­ды — от 1 до 10 мл; в качестве питательной среды обычно исполь­зуют МПБ или любой другой, соответствующий питательным потребностям возбудителя. В пробирках (обычно 8) готовят серию двойных разведений препарата на питательной среде. Концентра­ция уменьшается соответственно от 128 до 0,06 мкг/мл (базовая концентрация варьирует в зависимости от активности препарата). Конечный объем среды в каждой пробирке составляет 1 мл; конт­ролем служит пробирка с питательной средой. В каждую пробирку вносят по 0,05 мл физиологического раствора, содержащего 10⁶ микробных клеток/мл. Пробирки инкубируют 10... 18 ч при 37 "С (или до появления бактериального роста в контрольной про­бирке). По истечении указанного срока результаты учитывают по

65

изменению оптической плотности среды визуально или нефело-метрически.

1. МИК соответствует наибольшему разведению препарата, тормозящему рост тест-культуры.

2. МБК определяют при высеве 0,01 мл на плотную среду. От­ сутствие роста свидетельствует о бактерицидном действии. После инкубации в течение 18...20 ч выявляют наименьшую дозу препа­ рата, проявляющую бактерицидный эффект; обычно она соответ­ ствует либо превышает величины МИК.

Модификация метода, включающая использование МПБ, допол­ненного глюкозой и содержащего реактив Андраде. Бактериальный рост легко выявляют по покраснению среды в пробирках.

Микрот и I рационная модификация метода серийных разведений в жидких средах. Предназначена для определения МИК и МБК. Бо­лее экономична, так как используют микропланшеты: в каждую лунку вносят по 0,1 мЛ питательной среды.

Метод серийных разведений в плотных средах. Можно использо­вать в объемах агаризованной среды (5 или 10 мл). Во многом ана­логичен методу разведения в жидких средах, однако определение МБК требует более сложных манипуляций. Готовят двойные се­рийные разведения препарата от 1 : 10 000 до 1 : 320 000, затем вно­сят по 1 мл каждого разведения в пробирки, содержащие по 4 мл (или по 9 мл) охлажденного до 45 "С агара (соответствующего пи­тательным потребностям микроорганизма). Манипуляцию прово­дят одной пипеткой с перенесением препарата от меньшей кон­центрации к большей. Содержимое пробирки можно быстро вне­сти в чашки Петри либо пробирки «скашивают» до застывания агара. Затем агар засевают исследуемой стандартизированной тест-культурой (петлей или специальным дозатором, засевающим чашку 36 различными микроорганизмами) и инкубируют 18...20ч при 37 °С. После инкубации определяют МИК по отсутствию рос­та на чашках (пробирках), содержащих наименьшие концентра­ции препарата.

Определение чувствительности у анаэробов. Используют сравни­тельно редко, например при изучении нового препарата, периоди­ческом обследовании микробной флоры в стационарах, иногда индивидуально — обычно при абсцессах головного мозга, остео­миелитах, суставных заболеваниях, инфекциях различных проте­зирующих устройств или при рецидивирующих бактериемиях. Можно применять практически все вышеупомянутые методы, ис­ключая метод дисков (и используя соответствующую питательную среду). Следует иметь в виду, что устойчивость к р-лактамовым антибиотикам у видов Prevotella, Bacteroides часто обусловлена как способностью образовывать р-лактамазы, так и гидролизом самих препаратов (например, имипенема). Наиболее употребим метод серийных разведений в агаре, но и он, впрочем, не является «золо­тым стандартом».

66