2.5.Изучение генома человека.

Начальными этапами изучения генома человека можно считать разработку методов определения последовательности нуклеотидов или секвенирования ДНК (Гилберт У., Берг П., Сенджер Ф.), за которую в 1980 г была присуждена Нобелевская премия по химии. Через четыре года начались работы по полному секвенированию генома человека (Human Genome Projekt, финансированный конгрессом США - 3 млрд. долларов). К 2003 г была завершена полная расшифровка нуклеотидной последовательности генома человека. Последней была секвенирована самая большая хромосома человека (№ 1). Теперь каждый желающий теоретически может секвенировать весь свой геном за несколько минут, что обойдется ему в 1500 долларов.

В настоящее время считают, что в геноме человека 20-25 тысяч структурных генов, причем только 1% всей ДНК приходится на экзоны. Достаточно людям взглянуть друг на друга, чтобы понять, что существует генетическая вариабельность вида Homo sapiens. Структура геномов разных рас и национальностей идентична на 99,9%, а индивидуальная вариабельность составляет 0,1%. Различия между генотипами людей обусловлены в основном мутациями. Такую вариабельность и называют генетическим полиморфизмом, под которым понимают небольшие различия нуклеотидной последовательности, дающие нормальный фенотип. К полиморфизмам относят, например, однонуклеотидные замены – SNP, которые встречаются через каждые 300-400 п.о. в геноме человека. Большинство этих SNP располагаются в некодирующих участках. SNP легко идентифицировать ввиду их стабильности, и они могут использоваться в качестве маркеров для картирования генов, ответственных за такие мультифакториальные болезни, как диабет и атеросклероз. В настоящее время идентифицировано 4,0 млн. SNP, среди них значимыми внутригенными SNP являются 2,6 млн.

Следующим этапом исследования генома человека являлась программа ENCODE «Encyclopedia of DNA Elements». Геном человека или число нуклеотидов в гаплоидном наборе клетки насчитывает 3 млрд. пар оснований, из которых 10-20% являются кодирующими, а 80-90% являются некодирующими последовательностями, и поэтому основная часть ДНК не несет информацию о структуре белков, составляющих основу любого живого организма. Некодирующие последовательности представлены повторами разной протяженности, и для половины из них функции пока не известны, но предполагается, что в них содержится информация о программе индивидуального развития, которую называют партитурой «симфонии жизни». Именно она регулирует работу генов, процессинг РНК, точность матричных процессов, конъюгации и кроссинговера. Некодирующая ДНК может обеспечить компартментализацию геномов разных видов или может создавать основу для большей генетической изменчивости. Транскрибируемая часть генома составляет лишь 10%, причем из них 25% приходится на синтез РНК, и 5% транслируется до белков.

По данным ENCODE последовательности ДНК, не несущие инфрмацию о структуре белка, кодирует разные виды РНК - тРНК, рРНК и регуляторные РНК: малые интерферирующие РНК (small interfering RNA, si RNA) и микроРНК (microRNA, mi RNA). Все малые регуляторные РНК влияют на экспрессию генов на разных уровнях – синтеза РНК и посттранскрипционных модификаций, сплайсинга пре-РНК, стабилизации РНК, трансляции, они участвуют в геномном импринтинге, метилировании ДНК и ремоделировании хроматина. Действие таких РНК основано на феномене РНК-интерференции, суть которого заключается в подавлении экспрессии генов на уровне транскрипции или трансляции.

Указанные выше si RNA работают как кофакторы РНК-азных комплексов, вызывающих деградацию определенных ненужных клетке и-РНК. РНК-интерференцию можно использовать для нокдауна генов. Различают понятия «нокаут» и «нокдаун» генов. При нокауте гена индуцируются мутации, повреждающие и выключающие ген. При нокдауне гена вызывается деградация синтезированной с него и-РНК с помощью si-RNA. Введение siРНК в клетки пациентов является частью инновационной стратегии, снижающей активность генов, при лечении некоторых видов рака, гепатита и других заболеваний.

Микро РНК - mi RNA класс некодирующих шпилечных РНК, которые имеют длину около 22 нуклеотидов. Структура mi-РНК закодирована в геноме, гены mi-РНК расположены в областях инвертированных повторов интронов белок - кодирующих генов, в экзонах или межгенных областях. Они могут временно выключать трансляцию белков за счет своей гибридизации с комплементарным участком и-РНК, образуя двойную спираль РНК-РНК в норме не характерную для клеток.

Кроме того обнаружены другие классы регуляторных РНК, к которым относятся - малые ядерные РНК (snRNA), участвующие в сплайсинге иРНК; теломеразные РНК; малые ядрышковые РНК (snoRNA) и рибозимы - cRNA, участвующие в модификации других РНК; длинные некодирующие РНК - lincRNA (long noncocling RNAs) с неизвестной пока функцией, содержащие примерно более 200н; piRNA (piwi - interacting RNA)- короткие молекулы длиной в 24–30 нуклеотида, закодированные в центромерных и теломерных областях хромосомы, возможно участвующие в организации хроматина. Оказалось, что последовательности нуклеотидов piRNA комплементарны мобильным генетическим элементам и могут подавлять активность МГЭ на уровне транскрипции и репликации. Гены piRNA активны только в зародышевых клетках во время эмбриогенеза.

Все виды регуляторных РНК синтезируются с ¾ нашего генома, т.е. примерно 80,4% геномных последовательностей так или иначе участвуют в регуляторных процессах.

Оказалось, что у больных с наследственной патологией одинаковые SNP-замены расположены в генах регуляторных РНК, а не в структурных генах белков.

3. Методы изучения мутаций у человека.

В зависимости от типа мутации, которую предполагают выявить у человека, используют либо цитогенетические, либо молекулярно-генетические методы. С помощью цитогенетических методов можно выявлять у пациентов хромосомные и геномные мутации, а с помощью молекулярно-генетических – генные мутации.