7.Тестирование лекарственных препаратов.

7.1.Традиционный цитогенетический анализ.

Существует перечень тест-систем для быстрой оценки генетической активности химических соединений, утвержденный государственным фармакологическим комитетом. К нему относится анализ хромосомных аберраций (перестроек) в периферической крови человека после применения препаратов, выявление микроядер в гепатоцитах человека (микроядра – это хромосомы без центромер, не попавшие в ядро при митозе), выявление разрывов ДНК в гепатоцитах млекопитающих и анализ хромосомных аберраций в костном мозге млекопитающих (крыс, мышей).

7.1.1. Анафазный метод.

Анафазный метод основан на анализе хромосомных аберраций в анафазе митоза в клетках красного костного мозга мышей. У мышей в ядрах соматических клетках содержится 40 хромосом. С помощью анафазного метода можно выявлять последствия хромосомных мутаций – так называемые мосты и фрагменты хромосом, которые образуются в результате митотического кроссинговера между негомологичными хромосомами (в G2 –периоде или в профазе митоза). Кроссинговер происходит на стадии 2-хроматидных хромосом, в результате чего одна из вступивших в обмен хромосом будет иметь 2 центромеры (дицентрик), а вторая – ни одной (ацентрик). В анафазе центромеры обеспечивают расхождение хромосом к клеточным центрам, поэтому дицентрики окажутся растянутыми в виде «моста», который разорвется при дальнейшем делении в произвольном месте. Ацентрик в ядро не попадет и разрушится в цитоплазме клетки. Такой незаконный митотический кроссинговер могут провоцировать мутагенные химические соединения. При исследовании их мутагенной активности используют лабораторных мышей, которым вводят мутаген, а затем выделяют и фиксируют клетки красного костного мозга. Препарат костного мозга методично изучают при большом увеличении (объектив 40 или 90) светового микроскопа, подсчитывая отдельно количество нормальных анафаз и телофаз, анафаз с одиночными мостами или с множественными мостами, с фрагментами. Временный препарат сохраняется в течении 1-1,5 часов. Для получения статистически достоверного результата у одного животного исследуют до 200 анафаз и телофаз.

7.1.2.Методика учета частоты мутаций и статистическая обработка.

Частоту хромосомных аберраций вычисляют по формуле:

Х = ∑ Хi / n (в %) , где X - средняя частота хромосомных аберраций для отдельной группы ( в группе не менее 4 животных), Xi –частота ХА для отдельного животного, n – общее количество животных в группе. Достоверность различий между группами оценивают с помощью критерия Стьюдента для вероятности 0,95.

7.2.Современный подход к тестированию препаратов.

В 20 веке тестирование лекарственных препаратов проводилось in vivo на лабораторных линиях мышей. Однако геном мыши и человека, а также их клеточные белки существенно различаются, что не всегда позволяет применять получаемые результаты к человеку. В связи с этим с начала 21 века начали создавать искусственные модели с использованием культуры человеческих клеток для тестирования препаратов. В 2009 году разработан проект «Человек на чипе», в котором используются культуры клеток разных органов. Такой «чип» представляет собой трехслойную структуру размером с обычный препарат для микроскопирования. Нижний слой представляет собой предметное кварцевое стекло, на нем второй слой из бесцветного прозрачного полимера. Внутри второго слоя проложены тонкие прямоугольные каналы (аналог кровеносной системы) и сделаны ячейки, в которые помещают клеточные модели органов. По системе каналов циркулирует питательная среда. Для создания такой конструкции из силикона используют метод фотолитографии. Жидкость движется толчками, аналогично крови под действием сердца. Ячейки для органов содержат обязательные модели кишечника и печени, а в остальные ячейки можно помещать любые интересующие «органы». Третий, верхний, слой - прозрачная панель из полимера, придающая конструкции жесткость. В панель вкручиваются ячейки с клетками, трубки для управления и т.п.

Сначала клетки органов выращивают вне чипа 2-3 недели, в каждую ячейку помещают порядка 50 тысяч клеток, образующих монослой, если же число клеток составляет до миллиона, то они образуют сфероид (аналог мозга). В условиях эксперимента клетки живут в чипе около 28 дней, т.к. по европейским стандартам лекарство должно тестироваться на острую и хроническую токсичность именно 28 дней. Лекарство вводят в тот «орган», через который оно попадает в организм (кишечник, легкие, кожа) и изучают ответ на него со стороны других органов. Изучают как биохимические данные (состав среды чипа, состав цитоплазмы клеток), так и генетические (изучают активность определенных генов в клетках органов по количеству РНК в клетке). С помощью микроскопирования анализируют количество погибших клеток.

В 2012 году такие приспособления для анализа делали только в России и Германии. Российское устройство называется микробиореактор «Гомункулюс», его создали в институте «БиоКлиникум». Прибор стоит около 10 тысяч евро (400 тыс.рублей), одноразовый чип – 5 тысяч рублей.

В качестве обобщения всего изложенного ранее можно сказать, что недостаточное внимание к выявлению наследственной патологии, еще часто, к сожалению, встречающееся в нашей стране, приводит к неэффективности лечения, преждевременной смерти людей и к рождению детей с наследственными дефектами. Очевидно, что эта проблема могла бы быть решена хотя бы отчасти, если бы врачи владели информацией о современных достижениях генетики, которые облегчают профилактику, диагностику и лечение наследственных заболеваний.