3.2.Молекулярно-генетические методы.

Молекулярно-генетический анализ используют в практической медицине для исследования ДНК на уровне генных и микрохромосомных мутаций, т.е. изменений затрагивающих относительно небольшие последовательности нуклеотидов в ДНК. Молекулярные методы применимы для выявления вирусоносителей, для определения генов тканевой совместимости при трансплантации, для идентификации мутантных аллелей генов мультифакториальных болезней, при геномной дактилоскопии и в пренатальной диагностике.

Анализ ДНК является достаточно трудоемким и многоэтапным, но дающим высокую достоверность получаемых результатов. Современные ДНК-технологии основаны на биохимических методиках - выделения ДНК, использования полимеразной цепной реакции, электрофореза, секвенирования ДНК, анализа полиморфизма длины рестрикционных фрагментов, гибридизации ДНК, серийного анализа генетической экспрессии.

3.2.1.Этап выделения днк.

Выделения ДНК возможно из любых клеток, содержащих ядро. Самым доступным материалом являются лейкоциты, выделенные из 5-20 мл периферической крови. В случае пренатальной диагностики используют биоптаты хориона или плаценты (7-9 неделя беременности), клетки амниотической жидкости (15-18 неделя беременности), лимфоциты из пуповины плода при кордоцентезе (23-25 неделя беременности).

3.2.2. Этап проведения пцр.

Как правило, выделенной ДНК недостаточно для проведения дальнейшего анализа, поэтому её количество увеличивают с помощью ПЦР (полимеразной цепной реакции). ПЦР характеризуется высокой специфичностью и чувствительностью, простотой и удобством проведения и сравнительно небольшими затратами. В процессе ПЦР происходит циклический синтез in vitro (в пробирке) определенного фрагмента ДНК длиной от десятков до тысяч пар оснований (п.о.). Участки ДНК, расположенные в начале и в конце этого фрагмента должны быть исходно известны. В реакционную смесь вносят два праймера-затравки, один из которых узнает «начало» фрагмента , а второй – «конец». В пробирку, кроме праймеров, добавляется смесь всех четырех дезоксирибонуклеозидтрифосфатов (dNTP), содержащих аденин, гуанин, тимин и цитозин (A, G, T, C). В ходе реакции происходит многократная репликация цепей фрагмента ДНК, расположенных между двумя участками, комплементарными праймерам.

Для репликации в смесь добавляют термостабильный фермент ДНК-полимеразу (DNA-pol) , выделенная из термофильной бактерии Thermus aquaticus. Оптимальной для деятельности этого фермента является температура в районе +70 ⁰С. Другое важное свойство фермента – способность сохранять активность после длительной инкубации при +95⁰.

Существует несколько видов ПЦР. В практическое здравоохранение внедряется технология ПЦР в реальном времени (Real-Time PCR). Количественный анализ образующихся продуктов ПЦР и интерпретация полученных данных осуществляется одновременно с прохождением полимеразной цепной реакции. Такая ПЦР не требует электрофореза.

3.2.3. Этап проведения электрофореза ДНК.

Электрофорез используют чаще всего для разделения фрагментов ДНК по размеру, а также в качестве подготовительного этапа для гибридизации ДНК. При электрофоретическом разделении фрагментов ДНК возможно выявление увеличения размера изучаемой ДНК в случае возникновения у пациента инсерции, дупликации или динамической мутации при болезнях экспансии, а также уменьшение размера ДНК при делециях .

Анализ ДНК у родственников пациента с болезнью экспансии поможет выявить у них состояние премутации, при котором еще нет клинических проявлений болезни, но повышается риск рождения больного ребенка у носителя премутации. Например, при синдроме Мартина-Белла (с. ломкой Х-хромосомы) выделяют относительно здоровых членов семьи, имеющих состояние премутации в гене FMR1 , выражающееся в превышении числа тринуклеотидных повторов CGG (55-200) по сравнению с нормой (29-31) , но не достигающего критического значения (более 230). Таких относительно здоровых членов семьи называют нормальными «трансмиттерами», поскольку они имеют легкие клинические проявления слабой степени аутизма и умственной отсталости. Яркая картина заболевания проявляется только после достижения порогового значения числа тринуклеотидных повторов. При увеличении числа повторов (CGG) в инициаторе гена происходит необратимое метилирование инициатора и, как следствие, выключение гена. Поскольку его продуктом в норме является белок, участвующий в транспорте нейромедиатора, то данное нарушение приводит к тяжелой форме умственной отсталости, аутизму, СДВГ (синдрому нарушения внимания и гиперактивности). Существует прямая корреляция между числом повторов и тяжестью заболевания.

Электрофорез чаще всего проводят в агарозном или полиакриламидном гелях (ПААГ). Агарозные гели могут, например, иметь концентрацию 0,85% или 1,5%. Концентрация ПААГ может быть выше (2-18 %). Чем выше концентрация, тем меньше размер пор в геле и тем меньше размер фрагмента ДНК, который может пройти через эти поры. Гель заливают в виде пластины, которую помещают в камеру, заполненную буферным раствором. На одну контрольную дорожку геля наносят маркерную ДНК - окрашенные пробы ДНК известного размера. Через раствор пропускают электрический ток. Отрицательно заряженные фрагменты нуклеиновых кислот под действием тока движутся по гелю от катода к аноду. Более крупные фрагменты идут медленнее и остаются ближе к старту, чем более мелкие. Когда окрашенные полосы ДНК приближаются к противоположному от «старта» краю геля, ток отключают, гель помещают в раствор бромистого этидия, который связывается с ДНК и окрашивает ее в ультрафиолетовом свете длиной волны 306 нм. В агарозных гелях обычно разделяют фрагменты длиной от 100 п.о. до 60 тыс.п.о., а в ПААГ – от 100 п.о. до 1 тыс. п.о.