3.Афінна хроматографія. Принцип розділення. Гель-хроматографія. Суть методу. Застосування в аналізі.

3) Афі́нна хроматогра́фія — хроматографічний метод розділення біохімічних сполук, заснований на специфічній біохімічній взаємодії між молекулами, наприклад, взаємодії між антигеном і антитілом, ферментом і субстратом або рецептором і лігандом. Адсорбційна хроматографія комбінує можливості гелевої хроматографії фракціонувати молекули за розміром із здатністю створення стаціонарної фази, що дозволяє оборотне зв'язування відомих молекул.

В гель-хроматографії (гель-фільтраційній) хроматографії молекули речовин розділяються за розміром за рахунок їх різної здатності проникати в пори носія. При цьому першими виходять з колонки найкрупніші молекули (молекулярної маси), здатні проникати в мінімальне число пор носія. Останніми виходять речовини з малими розмірами молекул, які вільно проникають у пори сорбенту.

 Як НФ в ЦПХ використовують частки, що мають певні розміри пор. Це різного роду гелі (м'які, напівтверді і тверді). Як ПФ служать водні або органічні елюент. Принцип поділу молекул в ЦПХ полягає в тому, що молекули аналізованих речовин розподілені між нерухомим розчинником в порах сорбенту і розчинником, що протікає через шар НФ. Молекули, які мають розміри, що дозволяють їм проникати в пори сорбенту при русі вздовж колонки, частину часу втрачають на перебування в порах. Молекули, що мають розміри, що перевищують розміри пір, не проникають в сорбент і вимиваються з колонки зі швидкістю руху елюента. Молекули, які проникають в пори всіх розмірів, рухаються найбільш повільно. Зниження швидкості руху речовин вздовж колонки тим більше, ніж в більше число пір здатні дифундувати розподіляються частки.

 Таким чином, за допомогою ЦПХ можна розділити суміші речовин залежно від розмірів їх молекул.  Вихід речовин з колонки відбувається у порядку зменшення їх молекулярної маси. Так можна розділити поліпептиди, білки та інші макромолекули.

 Гель-проникаюча хроматографія на колонці використовується для очищення пестицидів, а також жиророзчинних вітамінів перед їх визначенням методом ВЖХ.

4.Хроматографія в тонкому шарі сорбенту. Механізми розділення речовин в тонкому шарі. Величина Rf. Фактори, що впливають на цю величину

4) Тонкошарова хроматографія (ТШХ) є одним з найбільш простих і ефективних експрес-методів розділення і аналізу речовин у харчових продуктах, біологічних рідинах і інших об'єктах, що не вимагають складного устаткування. У той же час метод має високу вибірковість і чутливістю (низькою межею виявлення). Цим методом можна визначити 10-20 мкг речовини з точністю до 5-7%.

У залежності від природи НФ тонкошарова хроматографія може бути адсорбційної і розподільної. Найбільш широко застосовується в ТШХ перший варіант поділу. Нерухома тверда фаза (оксид алюмінію, силікагель і ін) тонким шаром наноситься на скляну, металеву (алюмінієва фольга) або пластмасову пластинку, закріплюється шар за допомогою крохмалю або гіпсу (іноді використовують платівки з незакріпленим шаром). Для хроматографування можуть використовуватися готові пластинки, що випускаються промисловістю, розміром 5х15 або 20х20 см.

На відстані 2 см від краю пластинки на стартову лінію за допомогою мікропіпетки або микрошприца наносять проби аналізованого розчину (діаметр плям 3-5 мм). Після випаровування розчинника край платівки поміщають в скляну камеру, на дно якої налитий розчинник (ПФ) в кількості, достатній для утворення шару глибиною 0,5 см. Камеру закривають кришкою. Вибір розчинника (ПФ) залежить від природи сорбенту і властивостей аналізованих сполук. Наприклад, поділ хлорорганічних пестицидів на платівці з силікагелем проводять у середовищі гексану. Часто застосовують суміші розчинників з двох або трьох компонентів. Так, при хроматографування амінокислот використовують суміш Н-бутанолу з оцтовою кислотою і водою, при аналізі неорганічних іонів - водні буферні розчини, що створюють постійне значення рН.При хроматографування розчинник рухається знизу вгору (висхідний варіант) вздовж шару сорбенту і з різною швидкістю переносить компоненти суміші, що призводить до їх просторового розділення. Після закінчення хроматографічного процесу платівку виймають з камери, відзначають лінію фронту розчинника (зазвичай близько 10 см) і висушують.

 Ідентифікацію речовин на хроматограмі здійснюють за характером забарвлення плям, параметру утримування R f і за допомогою стандартних речовин (свідків). При стандартних умовах величина R f є постійною величиною, характерною для даного з'єднання. Але практика показує, наскільки важко створювати сталість всіх факторів, від яких залежить відтворюваність значень R f. На величину R f впливає якість і активність сорбенту, його вологість, товщина шару, якість розчинників та інші фактори, не завжди піддаються достатньому контролю. Тому поряд з величиною R f ідентифікацію проводять по "свідка".  Стандартне речовина (свідок), наявність якого припускають в аналізованій суміші, наносять на лінію стандарту поруч з досліджуваної пробій. Таким чином, стандартне речовина хроматографується в тих же умовах. Після хроматографування і детекції плям порівнюють величини R f визначається речовини і "свідка".