Определение содержания углеводов методом тонкослойной хроматографии
Цель работы: ознакомиться с методом тонкослойной хроматографии углеводов.
Принцип метода. При проведении хроматографического разделения углеводов методом тонкослойной хроматографии пластинку с тонким слоем пористого носителя (например, пластинку SiluFol), на которую нанесены растворы углеводов, помещают в растворитель, который, продвигаясь за счет капиллярных сил, перемещает углевод. По завершению хроматографии проводят обработку пластинки, позволяющую выявить пятна углевода, и расчетным методом определяют массу углевода в исследуемом растворе.
Оборудование и реактивы: пластинки Silufol или SilufoI–UV, исследуемый (раствор меда) и стандартный (10 мкг в пробе) раствор углевода (глюкозы, галактозы, фруктозы, сахарозы, мальтозы), растворитель — смесь бутанол-ацетон-вода (4:5:1), в случае использования пластинок Silufol нафторезорциновый реактив (свежеприготовленная смесь равных объемов 20 %-го водного раствора трихлоруксусной кислоты и 0,2 %-го спиртового раствора нафторезорцина). Микропипетки, пульверизатор в случае использования пластинок SilufoI или источник ультрафиолетового света в случае использования пластинок Silufol–UV, хроматографическая камера, линейка, простой карандаш, планиметр, сушильный шкаф.
Ход работы
Ha пластинке на расстоянии2 смот нижнего края (линия старта) аккуратно намечают карандашом три точки нанесения растворов углеводов. C помощью микропипетки в отмеченные места наносят равные объемы исследуемого раствора углевода (5 – 20 мкг в пробе), разбавленного исследуемого раствора углевода и стандартного раствора углевода таким образом, чтобы получить пятна одного диаметра. После высушивания пятен пластинку помещают в хроматографическую камеру, на дне которой находится растворитель — смесь бутанол-ацетон- вода (4 :5:1). Высота слоя растворителя —1 см. Хроматографию проводят до прохождения растворителем10 смот линии старта. После этого хроматограмму высушивают и проявляют. При использовании пластинок Silufol хроматограмму опрыскивают из пульверизатора раствором нафторезорцина и сушат в сушильном шкафу 5 – 10 мин при температуре 90 – 100 ºС для проявления пятен углевода. Пятна глюкозы и галактозы имеют сине–фиолетовый цвет, фруктозы — красно–черный, сахарозы и мальтозы — красный, лактозы — красно–фиолетовый, рамнозы — зеленый, ксилозы — светло–серый, манозы — светло–синий, арабинозы — сине–зеленый.
B случае использования пластинок Silufol–UV пятна углевода выявляют под ультрафиолетовым светом.
Определяют площадь пятен. Массу углевода в пробе исследуемого раствора (мкг) рассчитывают по формуле
,
где Мst – масса углевода в пробе стандартного раствора;
Sst, S, Sp – площади пятна стандарта; исследуемого раствора и разбавленного исследуемого раствора;
P – фактор разведения.
Оформление работы
Привести расчеты по приготовлению реактивов. Провести ТСХ углеводов, идентифицировать их и определить содержание в пробе.
Тема: БЕЛКИ
Белки, или протеины (в переводе с греческого означает «первые» или «важнейшие»), присутствуют во всех клетках. На их долю у животных приходится около половины сухой массы, у растений – 20–35 %. В белках массовая доля углерода в среднем составляет ~ 50 %, водорода ~ 7 %, кислорода ~ 23 %, азота ~ 16 %, серы ~ 1–3 %. В их составе также встречаются и другие химические элементы.
Белки – наиболее многочисленные и исключительно многообразные по функциям макромолекулы, играющие фундаментальную роль в формировании и поддержании структуры и функций живых организмов. С белками в живом организме связаны такие биологические процессы, как рост, деление, размножение и развитие клеток, реализация наследственной информации, мышечные сокращения, нервная деятельность, обмен веществ и т.д.
Белки – это высокомолекулярные биополимеры, структурную основу которых составляют полипептидные цепи, состоящие из аминокислотных остатков, связанных друг с другом пептидной связью. При их гидролизе образуются аминокислоты. В составе белков встречаются двадцать стандартных аминокислот. Для каждой стандартной аминокислоты существует генетический код, при помощи которого в генах записана информация о кодируемом белке. Кроме двадцати стандартных аминокислот, в составе белка встречаются и другие аминокислоты, они образуются в результате модификации стандартных аминокислот, после того как последние были включены в состав молекулы белка. Например, в составе белка коллагена содержится 5-гидроксилизин, который образуется в результате модификации стандартной аминокислоты лизина:
Кроме аминокислотных остатков, в состав белков могут входить и другие компоненты: ионы металлов, углеводы, липиды, нуклеиновые кислоты и др. Многообразие белков определяется не только их качественным составом, но и числом аминокислотных остатков, и прежде всего порядком их чередования в молекуле. Потенциально разнообразие белков безгранично.
Между аминокислотными остатками в молекуле белка существуют различные химические взаимодействия, это – ковалентные, ионные, водородные связи, гидрофобные взаимодействия, ван-дер-ваальсовы силы.
Отмеченные выше химические связи и взаимодействия принимают участие в формировании структуры белковых молекул. Благодаря пептидным связям образуются полипептидные цепи и, таким образом, формируется первичная структура белка. Пространственная организация белковой молекулы определяется в основном водородными, ионными связями, ван-дер-ваальсовыми силами, гидрофобными взаимодействиями. Водородные связи, возникающие между пептидными группами, определяют вторичную структуру белка. Формирование третичной и четвертичной структуры осуществляется водородными связями, образующимися между радикалами полярных аминокислот, ионными связями, ван-дер-ваальсовыми силами, гидрофобными взаимодействиями. Дисульфидные связи принимают участие в стабилизации третичной структуры.
Белки выполняют разнообразные функции. В связи с этим среди них различают структурные, питательные, запасные, сократительные, транспортные, каталитические, защитные, рецепторные, регуляторные и др. белки