Гидролиз нуклеопротеинов При выполнении данной работы следует соблюдать особую осторожность!

Гидролиз нуклеопротеинов протекает в кислой среде по нижеприведенной схеме.

 

Реактивы: осадок нуклеопротеинов, полученный в предыдущей работе; 5 %–й раствор серной кислоты; концентрированная серная кислота; 10 %–й раствор гидроксида натрия; 20–25 %–й раствор аммиака; 1 %–й раствор сульфата меди; 1 %–ый спиртовой раствор тимола; 1 %–й раствор нитрата серебра; молибденовый реактив (3,75 г молибдата аммония растворяют в 50 см³ воды и добавляют 50 см³ 32 %–го раствора азотной кислоты (плотностью 1,200 г/ см³). Полное растворение молибдата аммония происходит при добавлении кислоты).

Оборудование: круглодонная колба с обратным холодильником; электрическая плитка; воронка для фильтрования; индикаторная бумага; бумажный фильтр.

Ход работы

Задание 1. Гидролиз нуклеопротеинов.

1. Осадок нуклеопротеинов, полученный в предыдущей работе, растворите в 25 см³ 5 %–го раствора серной кислоты и перенесите в круглодонную колбу.

2. Колбу закройте пробкой с обратным холодильником. Реакционную смесь нагрейте на электрической плитке до кипения и кипятите в течение 1,5 ч.

3. Смесь охладите и профильтруйте через бумажный фильтр. С фильтратом проделайте реакции нижеследующих заданий.

Задание 2. Обнаружение полипептидов.

1. К 2 см³ фильтрата прилейте 2 см³ 10 %–го раствора щелочи и 2 капли раствора сульфата меди. Образуется характерное для полипептидов окрашивание.

Задание 3. Обнаружение пуриновых оснований.

1. К 5 каплям 1 %– го раствора нитрата серебра приливайте концентрированный раствор аммиака до растворения образовавшегося вначале осадка.

2. В другую пробирку влейте 2 см³ фильтрата (задание 1) и приливайте к нему концентрированный раствор аммиака до щелочной по индикаторной бумаге реакции.

3. Во вторую пробирку влейте содержимое первой пробирки. Через несколько минут выпадают хлопья солей пуриновых оснований.

Задание 4. Обнаружение пентоз.

1. К 1 см³ фильтрата добавьте 2–3 капли 1 %–го раствора тимола и по стенке пробирки ОСТОРОЖНО наслоите

1 см³ концентрированной серной кислоты. Жидкость окрашивается в красный цвет.

Задание 5. Обнаружение фосфорной кислоты.

1. К 1 см³ фильтрата прилейте равный объем молибденового реактива.

2. Содержимое пробирки нагрейте до кипения и кипятите в течение 2–3 минут. Появляется желтое окрашивание, обусловленное образованием комплексной соли. При стоянии выпадает желтый осадок.

Оформление результатов

Опишите ход выполнения работы, опишите компоненты входящие в состав нуклеопротеинов

Лабораторная работа № 3

Выделение нуклеопротеидов из печени

 Реактивы: 5% –й  раствор хлорида натрия,  дифениламиновый реактив (1г дифениламина в 100 мл ледяной уксусной кислоты,

+ 2,75мл H₂SO₄ конц.), печень, дистиллированная вода. Оборудование: гомогенизатор, центрифуга, центрифужные весы, центрифужные пробирки, стакан химический на 100 мл, пипетка на 10 мл, цилиндры на 25 и 50 мл, стеклянные палочки, штатив с пробирками, водяная баня

Ход работы

Навеску ткани печени 500 – 100 мг гомогенизируют в 5—10 мл 5%– го раствора хлорида натрия. Полученный гомогенат переносят в центрифужные пробирки, уравновешивают их на цент­рифужных весах и центрифугируют 10 – 15 минут при 1500 – 3000 об/мин

Надосадочную жидкость делят на 2 части. В одной из пробирок проводят качественную реакцию на ДНК (см. ниже). Вторую пробирку помещают в кипящую  водяную баню, предварительно добавив 3 мл 2 % – го раствора серной кислоты для проведения гидролиза  (гидролиз проводят в течении часа). Гидролизат охлаждают, центрифугируют. В надосадочной жидкости содержатся составные компоненты  нуклеопротеидов. Надосадочную жидкость разделяют на 3 части и проводят следующие качественные реакции: 1) на пуриновые основания, 2) на углеводную группировку, 3) на фосфорную кислоту.

Реакция на ДНК К 10 каплям раствора при­ливают 10–15 капель дифениламинового реактива, пере­мешивают и ставят в кипящую водяную баню на 10 – 15 минут. При нагревании дезоксирибонуклеопротеиды гидролизуются, а освободившаяся дезоксирибоза реагирует с дифениламином. Раствор дифениламина в смеси с уксусной и серной кислотами дает при нагре­вании с дезоксирибозой серо–синее окрашивание.

1. Проба на пуриновые основания. К 10 каплям гидролизата добавляют 1 каплю концентрированного раствора аммиака для нейтрализации и 5 капель 1% – го раствора AgNO₃. При стоянии выпадает рыхлый осадок бурого цвета, обусловленный образованием соедине­ний серебра с пуриновыми основаниями.

2. Качественные реакции на углеводы (рибозу и дезоксирибозу). Эти реакции основаны на способности рибозы и дезоксирибозы восстанавливать ионы металлов (медь, висмут, железо) в щелоч­ной среде.

К 5 каплям гидролизата добавляют 5 капель 30% –  го раствора гидроксида натрия  и несколько капель 7 % –го  раствора сульфата меди до появления неисчезающей мути гидро­окиси меди (II) Сu(ОН)₂. При нагревании до кипения выпа­дает желтый осадок гидрата меди (I) СuОН или красный осадок оксида меди (I) Сu₂О.

3  Молибденовая проба на фосфорную кислоту.  К 5 каплям гидролизата добавляют 10 капель молибденово­го реактива, представляющего собой раствор молибденовокислого аммония в азотной кислоте, и кипятят. При охлаждении пробирки под струей холодной водопровод­ной воды выпадает кристаллический осадок лимонно–желтого цвета, обусловленный образованием фосфорно–молибденовокислого аммония

Лабораторная работа №4