Определение общего содержания липидов в тканях

 Цель работы: ознакомиться с весовым методом определения общего содержания липидов в тканях.

Принцип метода. Липиды экстрагируют из тканей смесью Фолча, экстракт отмывают от нелипидных    примесей    солевым    раствором. Количественное определение суммарных липидов проводят весовым методом.

Реактивы:

1.  Хлороформ. 2.  Метанол. 3.  Смесь хлороформ – метанол в соотношении 2:1 по объему (смесь №1). 4.  NaCl 0,73 % водный раствор (можно заменить 0,88 % KCl, 0,05 % CaCl₂). 5.  Смесь растворителей, содержащая минеральные соли: хлороформ-метанол-водный раствор NaCl (0,58 %) или KCl (0,74 %) или СаС1₂ (0,04 %) в соотношении 3:48:47 (смесь №2).

Оборудование: пробирки, гомогенизатор, центрифуга, сушильный шкаф, аналитические весы.

Ход работы

Измельченную на холоде навеску ткани (200 – 250 мг мозга, 300 – 500 мг других тканей) помещают в гомогенизатор с тефлоновым или стеклянным пестиком, заливают 5 объемами смеси №1 и гомогенизируют в течение 5 мин. Экстракт отделяют от биомассы, сливают в мерный цилиндр. Процедуру повторяют еще 2 – 3 раза. Измельченную ткань вместе с экстрактом количественно переносят в мерный цилиндр (конечное разведение ткани 1:20), перемешивают и через 20 мин  фильтруют через обезжиренный фильтр или центрифугируют при 1000 gв течение 15 – 20 мин K центрифугату добавляют 0,73 %–й водный раствор хлорида натрия в объеме, составляющем 20 % от объема экстракта липидов. Экстракт перемешивают и центрифугируют при 600 g в течение 15 – 20 мин. После центрифугирования система разделяется на две фазы. Верхнюю фазу осторожно декантируют с помощью шприца и пипетки с оттянутым концом, отбрасывают. Поверхность нижней фазы и внутренние стенки центрифужной пробирки ополаскивают 3 мл смеси №2, тщательно следя за тем, чтобы не было перемешивания нижней фазы и промывной смеси. Последнюю отбрасывают и промывание повторяют еще 2 раза. После удаления промывной смеси к нижней фазе, т.е. к хлороформному раствору липидов, прибавляют по каплям метанол до образования однофазной системы, раствор перемешивают.

Количество липидов определяют весовым методом. Для этого круглодонную колбу для роторного испарителя доводят до постоянного веса, помещают в нее экстракт липидов, содержащий не менее 10 – 20 мг липидов, растворитель упаривают на роторном испарителе. Колбу с осадком липидов доводят до постоянного веса в вакуумэксикаторе над KOH. Путем повторного взвешивания определяют вес осадка липидов и рассчитывают содержание липидов в тканях в процентах с учетом взятой навески. Взвешивание проводят на аналитических весах.

Лабораторная работа №5

Определение содержания общих фосфолипидов в тканях

 Цель работы: ознакомиться с фотометрическим методом определения содержания общих фосфолипидов в тканях.

Принцип метода. Метод основан на определении неорганического фосфора, образованного при кислотном гидролизе фосфолипидов. Содержание фосфора определяют по образованию комплекса с молибдатом аммония и его восстановлению аскорбатом до появления интенсивно синего цвета с максимумом светопоглощения 750 нм.

Реактивы: молибдат аммония 2 % раствор; аскорбиновая кислота 2 % раствор; 20 % ТХУ; 40 % КОН, приборы и реактивы.

Оборудование: пробирки, кюветы, спектрофотометр, гомогенизатор, центрифуга с охлаждением.

Ход работы

К 0,5 мл раствора липидов в хлороформе прибавить 1 мл концентрированной хлорной кислоты и сжигать при температуре около 180 °C. После охлаждения объем довести водой до 2 мл, отобрать 0,2 мл и добавить 1,8 мл воды, a затем 0,2 мл 10% аскорбата, 2 мл 1 % молибдата аммония. После 20-минутной инкубации в 45 °C, измерить оптическую плотность при 750 нм. Аналогично поступить с пробой стандартного раствора фосфата и с пробой на чистоту реактивов (Кейтс, 1975).

Тема: БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ ВЕЩЕСТВА

Помимо углеводов, липидов, аминокислот и т.д., клетки и ткани содержат значительное количество биологических активных веществ, участвующих в регуляции метаболизма, интеграции метаболических процессов, проведении нервного импульса, защите клеток при стрессорных воздействиях. К ним можно отнести, нейромедиаторы, гормоны, витамины и многие другие молекулы.

Лабораторная работа №1

Качественные реакции на адреналин

   Адреналин – гормон мозгового слоя надпочечников, действующий на ткани мишени, повышая концентрацию циклического АМФ; ускоряет гликогенолиз, активирует липолиз, повышает уровень глюкозы в крови. Адреналин (эпинефрин) участвует в общих  системных эффектах возбуждения симпатической нервной системы.

Реактивы: 0,1 %–й раствор адреналина; 3 %–й раствор FeCl₃; 10 %–й раствор аммиака; 1 %–й раствор KIO₃; 10 %–й раствор уксусной или фосфорной кислот

Оборудование: пробирки, водяная баня.

Ход работы

Задание 1. Реакция с хлоридом железа (III).

1. К 0,5 см³ раствора адреналина добавьте 2 см³  дистиллированной воды и 1 каплю раствора хлорида железа. Содержимое пробирки окрашивается в изумрудно–зеленый цвет.

2. Добавьте 1 каплю раствора аммиака. Окраска переходит в вишнево–красную, а затем принимает коричневый оттенок.

Задание 2. Реакция с иодатом калия.

1. К 0,5 см³ добавьте 1 см³ раствора KIO₃, 10 капель         10 %–го раствора уксусной или фосфорной кислот и подогрейте на водяной бане до 60 – 65 ^оС. Появляется интенсивное красно–фиолетовое окрашивание.

  Опишите принцип метода и полученный результат.