18. Реакция преципитации

В этой реакции участвуют растворимые антигены (фильтраты, лизаты, экстракты), которые при взаимодействии с соответствующими антителами (преципитирующая сыворотка) выпадают в осадок. Преципитирующую сыворотку получают путем иммунизации лабор. животных растворимым антигеном.

Есть несколько вариантов реакции преципитации:

1) В жидкой среде - реакция кольцепреципитации. В пробирку наливают сыворотку и осторожно по стенке добавляют такое же количество антигена. При их взаимодействии на границе между сывороткой и антигеном образуется кольцо преципитации.

2) Реакция преципитации в геле (агаре). На стеклянную пластинку или чашку наливают агар, после застывания в нем де­лают лунки. В одни лунки вносят АТ, в другие - АГ. В процессе диффузии АГ+АТ при встрече АГ с АТ образуется линия преципитации.

Реакция преципитации очень чувствительна, позволяет обнаруживать минимальное количество антигена. Используется для диагностики различных заболеваний (сибирская язва, полиомиелит и др.), в судебной медицине (для определения видовой принадлежности белка), в санитарной практике ( для определения примесей в продуктах) и др.

3) Реакция преципитации для определения токсигенности (напр. дифтерийной палочки): на чашку Петри с агаром кладут фильтровальную бумагу, смоченную антитоксической сыворотку, рядом засевают исследуемые культуры. Если они выделяют токсин, то в процессе диффузии происходит взаимодействие токсина с антитоксической сывороткой и между бумагой и колонией образуется линия преципитации

19. Система комплемента.

Комплемент (С) - это совокупность белков сыворотки крови, обладающих ферментативной активностью. Известно около 20 белков, взаимодействующих между собой так, что каждый предыдущий белок активирует следующий, т.е. развивается цепная реакция активации белков комплемента. Наиболее важное значение имеют первых 9 белков С1, С2, С3, …С9.

Существует 2 пути активации комплемента: классический и альтернативный.

Классический путь активации включается комплексом аг+ат. Этот комплекс связывается с С1 qrs и активирует С4. При этом С4 расщепляется на С4а и С4b. С4b активирует С2, который так же расщепляется на С2а и С2b. С2а остается связанным с С4b. Этот комплекс называется конвертазой классического пути активации комплемента. Она расщепляет С3 на C3а и С3b. С3b присоединяется к конвертазе и этот комплекс активирует С5, который распадается на С5а и С5b. К С5b на мембране клетки присоединяются последовательно С6, С8, С9. Последние белки получили название мембраноатакующего комплекса (МАК), который встраивается в мембрану клетки, образует трансмембранные каналы, через которые в клетку поступает натрий и вода, а выходит калий, что приводит к лизису клетки.

Альтернативный путь активации С включается при действии любого антигена (микроб, токсин, лекарственный препарат), который активирует С3. При этом С3b связывается с фактором В –сыворотки и на этот комплекс С3bВ действует фактор D, который расщепляет фактор В на Ва и Bb. Комплекс С3bBb – конвертаза альтернативного пути стабилизируется белком Р (Пропердин). Конвертаза активирует С5 и дальнейшая активация не отличается от классического пути. Таким образом С3 является ведущим в активации комплемента по обоим путям. В процессе активации комплемента образуются биологически активные фрагменты, например С3а и С5а являются анофилотоксинами, вызывают аллергические реакции.

Реакция связывания комплемента (РСК) используется для обнаружения антител, микробных, вирусных и других антигенов. Сущность РСК состоит в том, что при образовании комплекса АГ+АТ к нему присоединяется комплемент. Этот процесс не определяется визуально. Чтобы обнаружить связывание комплемента добавляют гемолитическую систему - индикатор (эритроциты барана+гемолитическая сыворотка). Если комплемент связан с комплексом АГ+АТ, гемолиза не будет (РСК положительная). При отрицательной реакции, когда не образуется комплекс АГ+АТ, комплемент остается свободным и вызывает гемолиз эритроцитов в индикаторной системе. Комплемент для РСК получают из свежей сыворотки морской свинки. Перед реакцией его титруют при помощи реакции гемолиза, определяют титр и рабочую дозу.

Гемолитическую сыворотку получают путем иммунизации кроликов эритроцитами барана. Кроме этого перед постановкой РСК определяют рабочую дозу антигена, а так же исследуемую сыворотку прогревают при температуре 56^оС для разрушения собственного комплемента.

20. Динамика иммунного ответа.

Иммунный ответ развивается в несколько этапов:

1. Представление АГ.

Если АГ корпускулярный (микроб или другая частица), то он захватывается макрофагами, и фагоцитируется.

В итоге фагоцитоза макрофаг расщепляет чужеродный агент и в виде комплекса HLA ДR+АГ представляет Т-хелперам. При этом макрофаг активируется и выделяет интерлейкин-1 (ИЛ-1). ИЛ-1, активирует Т-лимфоциты и другие лейкоциты.

II. Индуктивная фаза иммунного ответа. Т-хелперы получив 2 сигнала от макрофагов, выделяют ИЛ-2 и антигенспецифические факторы.

III. Пролиферативная стадия. Эти факторы стимулируют пролиферацию Т-лимфоцитов и В-лимфоцитов.

IV. Эффекторная стадия. В-лимфоциты превращаются в плазматические клетки, которые синтезируют антитела. Параллельно возникают Т-эффекторы, которые имеют на своей поверхности рецепторы к данному АГ (антигенспецифические рецепторы). В результате под влиянием АГ в организме образуются антитела и иммунные Т-клетки.

V. Стадия затихания иммунного ответа. Одновременно с активацией Т-хелперов стимулируются Т-супрессоры, тормозящие иммунный ответ. Поэтому через определенное время в норме иммунная реакция затихает (останавливается). В организме остается иммунологическая память: долгоживущие Т и В клетки "помнят" о строении антигена, с которым они встречались.

Различают первичный и вторичный иммунный ответ.

Первичный иммунный ответ развивается после первого попадания АГ в организм. Количество антител нарастает и достигает максимального значения примерно через 2 недели. Первыми в течении 3-5 дней синтезируются IgМ, затем Ig G (они могут сохраняться в течение всей жизни). Может быть небольшое увеличение Ig А, Е, Д. Одновременно нарастает уровень иммунных Т-лимфоцитов, образуются иммунные комплексы (АГ+АТ). В зависимости от вида антигена преобладают иммунные Т-лимфоциты или антитела.

При вторичном иммунном ответе за счет клеток памяти стимуляция синтеза АТ и иммунных Т-клеток наступает быстро, через 1-3дня, количество АТ резко увеличивается. При этом сразу синтезируются Ig G, титры которых во много раз больше, чем при первичном ответе.