Подвижная фаза

В качестве ПФ могут применяться разнообразные растворители – как индивидуальные, так и их смеси.

В нормально-фазовой хроматографии обычно применяются жидкие углеводороды (гексан, циклогексан, гептан) и другие относительно неполярные растворители с небольшими добавками полярных органических соединений, которые регулируют элюирующую силу ПФ.

В обращено-фазовой хроматографии в состав ПФ входят полярные органические растворители (обычно ацетонитрил и метанол) и вода. Для оптимизации разделения часто используют водные растворы с определенным значением рН, в частности буферные растворы. Применяют добавки неорганических и органических кислот, оснований и солей и другие соединения (например, хиральные модификаторы для разделения энантиомеров на ахиральном сорбенте).

Контроль значения рН необходимо осуществлять отдельно для водного компоненента, а не для его смеси с органическим растворителем.

ПФ может состоять из одного растворителя, часто из двух, при необходимости – из трех и более. Состав ПФ указывают как объемное соотношение входящих в нее растворителей. В отдельных случаях может указываться массовое соотношение, что должно быть специально оговорено.

При использовании УФ-спектрофотометрического детектора ПФ не должна иметь выраженного поглощения при выбранной для детектирования длине волны. Предел прозрачности или оптическая плотность при определенной длине волны растворителя конкретного изготовителя часто указывается на упаковке.

На хроматографический анализ большое влияние оказывает степень чистоты ПФ, поэтому предпочтительно применять растворители, выпущенные специально для жидкостной хроматографии (включая воду).

ПФ и анализируемые растворы не должны содержать нерастворившихся частиц и пузырьков газа. Воду, полученную в лабораторных условиях, водные растворы, предварительно смешанные с водой органические растворители, а также анализируемые растворы необходимо подвергать тонкой фильтрации и дегазации. Для этих целей обычно применяют фильтрование под вакуумом через инертный по отношению к данному растворителю или раствору мембранный фильтр с размером пор 0,45 мкм.

Система сбора и обработки данных

Современная система обработки данных представляет собой сопряженный с хроматографом персональный компьютер с установленным программным обеспечением, позволяющим регистрировать и обрабатывать хроматограмму, а также управлять работой хроматографа и следить за основными параметрами хроматографической системы.

Перечень условий хроматографирования, подлежащих указанию

В частной фармакопейной статье должны быть приведены размеры колонки, тип сорбента с указанием размера частиц, температура колонки (если необходимо термостатирование), объем вводимой пробы (объем петли), состав ПФ и способ ее приготовления, скорость подачи ПФ, детектор и условия детектирования, описание градиентного режима (если используется), время хроматографирования.

Ионообменная и ионная вэжх

Ионообменная хроматография используется для анализа как органических (гетероциклические основания, аминокислоты, белки и др.), так и неорганических (различные катионы и анионы) соединений. Разделение компонентов анализируемой смеси в ионообменной хроматографии основано на обратимом взаимодействии ионов анализируемых веществ с ионными группами сорбента. В качестве сорбентов используются аниониты или катиониты. Эти сорбенты представляют собой, в основном, либо полимерные ионообменные смолы (обычно сополимеры стирола и дивинилбензола с привитыми ионными группами), либо силикагели с привитыми ионообменными группами. Сорбенты с группами —(СН₂)₃N⁺Х^– используются для разделения анионов, а сорбенты с группами —(СН₂)SО₃^–Н⁺ – для разделения катионов. Обычно для разделения анионов применяют полимерные смолы, а для разделения катионов – модифицированные силикагели.

В качестве ПФ в ионообменной хроматографии применяют водные растворы кислот, оснований и солей. Обычно используются буферные растворы, позволяющие поддерживать определенные значения рН. Возможно также использование небольших добавок смешивающихся с водой органических растворителей – ацетонитрила, метанола, этанола, тетрагидрофурана.

Ионная хроматография — вариант ионообменной хроматографии, в котором для определения концентрации ионов анализируемого вещества используется кондуктометрический детектор. Для высокочувствительного определения изменений электропроводности проходящей через детектор ПФ фоновая электропроводность ПФ должна быть низкой.

Существуют два основных варианта ионной хроматографии.

Первый из них основан на подавлении электропроводности электролита ПФ с помощью второй ионообменной колонки, находящейся между аналитической колонкой и детектором. В этой колонке происходит нейтрализация ПФ и анализируемые соединения попадают в ячейку детектора в деионизированной воде. Детектируемые ионы являются единственными ионами, обеспечивающими проводимость ПФ. Недостаток подавляющей колонки – необходимость ее регенерации через достаточно короткие промежутки времени. Подавляющая колонка может быть заменена непрерывно действующим мембранным подавителем, в котором состав мембраны непрерывно обновляется потоком регенерирующего раствора, движущегося в направлении, противоположном направлению потока ПФ.

Второй вариант ионной хроматографии – одноколоночная ионная хроматография. В этом варианте используется ПФ с очень низкой электропроводностью. В качестве электролитов широко применяют слабые органические кислоты – бензойную, салициловую или изофталевую.