3.2.2. Метод мембранной фильтрации

Метод мембранной фильтрации используют для количественного определения микроорганизмов в лекарственных средствах, обладающих или не обладающих антимикробным действием. Метод применим только для растворов и водорастворимых лекарственных средств, а также для жиросодержащих препаратов, растворимых в изопропилмиристате.

Для посева используют мембранные фильтры с диаметром пор не более 0,45 мкм, способные эффективно задерживать микроорганизмы, что подтверждается валидацией. Установка для мембранной фильтрации должна быть такой конструкции, из которой можно извлечь фильтры и перенести их на питательные среды. Материал мембраны следует выбирать таким образом, чтобы компоненты исследуемого препарата не влияли на его эффективность. Фильтры из нитрата целлюлозы используют для водных, масляных и разбавленных спиртовых растворов (менее 30 %), из ацетата целлюлозы – для спиртовых растворов (более 30 %), кислот, щелочей. Мембранную фильтрацию проводят в асептических условиях с помощью вакуума.

Образец, как правило, растворяют в буферном растворе в соотношении

1:10. В воронку фильтровальной установки вносят сначала промывную жидкость (примерно 5 мл) для смачивания фильтра. Добавляют 10 мл препарата в разведении 1:10, соответствующее 1 г образца, и немедленно фильтруют. В случае наличия антимикробного действия лекарственного средства для отмывания мембраны используют жидкости № 1, 2 или 3. Через фильтр пропускают минимум три порции по 100 мл подходящей стерильной промывной жидкости. При необходимости к промывной жидкости могут быть добавлены поверхностно-активные вещества (например, твин-80 (П48)) или инактиваторы антимикробного действия. Через одну мембрану можно пропустить не более 1000 мл жидкости. Допускается использование для отмывания мембран менее трех порций промывной жидкости при условии валидации метода.

Смыв с трансдермальных пластырей пропускают через мембранные фильтры по 50 мл (соответствует 1 пластырю) через каждую мембрану. По окончании процесса фильтрации мембраны переносят на соответствующие питательные среды, разлитые в чашки Петри. Чашки с фильтрами переворачивают и инкубируют в термостате.

Учет результатов

Подсчет колоний производят через 48-72 ч (предварительные результаты) и через 5 сут (окончательные результаты). Отбирают чашки, где число колоний бактерий на фильтрах не превышает 100, а грибов – 50, и рассчитывают число микроорганизмов на 1,0 г, или на 1,0 мл образца, или на

1 пластырь. Если на фильтре большее количество микроорганизмов, то делают ряд последовательных разведений образца и выбирают подходящее. ^{Для того, чтобы определить, полностью ли отмыты мембраны от филь-}

труемого препарата, обладающего антимикробным действием, после фильтрации раствора в последнюю порцию промывной жидкости вносят по отдельности по 1 мл взвеси B.subtilis ATCC 6633 и C.albicans ATCC 885-653, содержащей от 10 до 100 колониеобразующих единиц (КОЕ) в 1 мл.

Рост тест-штаммов на фильтрах подтверждает отсутствие антимикробного действия лекарственного средства. Напротив, отсутствие роста определенного микроорганизма свидетельствует о сохранении антимикробного действия лекарственного средства в отношении данного вида микроорганизмов. В этом случае используют специфические или неспецифические инактиваторы или увеличивают объем промывной жидкости.

Жидкости для промывания фильтров

Раствор натрия хлорида изотонического 0,9 % стерильного рН 7,0.

Жидкость № 1: 1 г мясного пептона растворяют в 1000 мл воды, фильтруют или центрифугируют для осветления, разливают во флаконы и стерилизуют. рН после стерилизации – 7,0 ± 0,2.

Жидкость № 2: 1 мл твина-80 добавляют к 1000 мл жидкости № 1, разливают во флаконы и стерилизуют. рН после стерилизации – 6,9 ± 0,2. Жидкость применяют, если в составе препарата имеется масло.

Жидкость № 3: 5 г мясного пептона, 3 г мясного экстракта и 10 г твина-80 растворяют в 1000 мл воды. Разливают во флаконы и стерилизуют. рН после стерилизации – 6,9 ± 0,2.