6.2 Определение методом титра обсемененности исследуемого объекта бактериями группы кишечной палочки

Метод титра, или метод предельных разведений, применяется для установления количества микроорганизмов отдельных физиологических групп, например: молочнокислых бактерий, уксуснкислых бактерий, группы кишечной палочки, анаэробных и др. Так как требования различных микроорганизмов разнообразны относительно условий выращивания, приходиться прибегать к избирательным (элективным) методом культивирования.

Сущность метода заключается в высевании определенных количеств исследуемого материала в сосуды с жидкой элективной средой. Для этого готовят ряд последовательных разведений взятой для анализа пробы. Выращивают посевы в условиях благоприятных для развития данных микроорганизмов. После выращивания посевов устанавливают, в каком наименьшем количестве исследуемого объекта еще находятся представители данной группы микроорганизмов, т.е. определяют их титр или наименьшее количество испытуемого объекта, в котором можно обнаружить искомые микроорганизмы.

В практике оценки доброкачественности пищевых продуктов и питьевой воды, для характеристики санитарного состояния производства применяется учет бактерий группы кишечной палочки (БГКП, коли–бактерии).

Бактерии этой группы представляют собой короткие, подвижные, бесспоровые палочки, грамотрицательные. Они факультативные анаэробы, температурный оптимум их роста 37^оС, сбраживают глюкозу, лактозу, спирт, маннит при температурах 43-45^оС за 24 часа. Коли-бактерии присутствуют в больших количествах в кишечнике человека и теплокровных животных. С фекалиями они попадают во внешнюю среду. Таким образом, обнаружение кишечной палочки на пищевых продуктах, руках персонала указывает на их фекальное загрязнение. Бактерии коли- тифозной группы (дизентерийные, брюшно - тифозные, паратифозные), также выделяются во внешнюю среду с фекалиями больных, но так как прямое определение этих патогенных м.о. затруднительно, то о их возможном присутствии судят по зараженности исследуемого объекта кишечной палочкой. Таким образом, коли – бактерии являются санитарно-показательными м.о. Чем больше их обнаружено на исследуемом объекте, тем ниже оценка его санитарного состояния. Количество кишечных палочек на исследуемом объекте выражают коли –титром и коли –индексом.

Коли – титр – наименьшее количество исследуемого объекта (в граммах или см³), в котором обнаруживают хотя бы одну клетку кишечной палочки.

Коли – индекс – количество кишечных палочек в 1см³ или 1г исследуемого объекта.

Работники СЭС при контроле санитарного состояния объекта определяют наличие кишечной палочки и общее количество бактерий (методом счета колоний).

План занятия.

1. Ознакомиться с сущностью учета м.о. методом титра.

2. Ознакомиться с морфологическими и физиологическими признаками бактерий группы кишечная палочка.

3. Отобрать и подготовить к анализу пробу исследуемого объекта.

4. Сделать разведение пробы и провести посев из разведений на элективные питательные среды для коли– бактерий.

5. По наличию продуктов жизнедеятельности через 24-48ч определить развитие коли –бактерий на среде Кесслера.

6. Определить коли –титр.

7. Из забродивших пробирок произвести посев на среду Эндо.

8. Установить наличие коли - бактерий на среде Эндо по морфологическим признакам.

Методические указания.

Занятие первое.

1. При исследовании твердого объекта из средней пробы стерильно отвесить для анализа (1-10г) продукта в стерильную бюксу и тщательно растереть. Растертый продукт перенести в стерильную колбу со 100 см³ физиологического раствора. Навески муки, соли, крупы вносят в колбу без растирания. Содержимое колбы встряхивать в течение 5мин. При этом получается смыв м.о., являющийся 1-ым разведением.

При исследовании воды, жидких и полужидких продуктов отобрать стерильной пипеткой 1см³ продукта и ввести в колбу со 100см³ стерильного физиологического раствора. Если предполагается небольшое количество бактерий, то 1см³ используют для посева без разведения. При исследовании смывов с объектов первым разведением является приготовленный смыв (50 или 100см³), из которого делается второе разведение. Из первого разведения стерильной пипеткой переносят 1см³ в первую пробирку с питательной средой и 1см³ в первую пробирку с 9см³ стерильного физраствора (второе разведение). Из второго разведения новой (второй) пипеткой 1см³ жидкости переносят во вторую пробирку с питательной средой и той же пипеткой 1см³ во вторую пробирку с 9см³ стерильного физраствора (третье разведение). Из третьего разведения новой (третьей) пипеткой 1см³ жидкости вносят в третью пробирку с питательной средой.

2. В результате в пробирку с элективной средой будет внесено исследуемой жидкости 1; 0,1; 0,01 см³.

3. Наклеить на пробирки с питательной средой этикетки с указанием разведения, фамилии студента и номера группы.

4. Поместить пробирки в термостат при 42-43^оС на 24-48ч.

Занятие второе.

5. Выявить наличие подкисления питательной среды и газообразования в опытных пробирках. Среды Булира, Хейфеца – изменяют цвета в результате кислотообразования (цвет среды Булира из желтого переходит в розовый, а среда Хейфеца из красно-фиолетового - в желто-зеленый). Среда Кесслера мутнеет, но меняет цвет незначительно. Наименьший объем (или вес) исследуемого материала вызвавший подкисление и газообразование (накопления газа в поплавке), и будет титром кишечной палочки. При отсутствии газообразования условно устанавливают титр по подкислению среды.

6. Из забродивших пробирок провести посев на чашки со средой Эндо, которая является дифференциально- диагностической для кишечной палочки.

7. Дно чашки Петри со средой Эндо предварительно расчертить на секторы по количеству забродивших пробирок, пронумеровать по номерам пробирок и засеять «штрихом» с помощью бактериологической петли из соответствующих пробирок.

8. На боковую поверхность чашки наклеить этикетку с указанием номера группы и фамилии студента. Чашки поместить в термостат на 24-48 ч при 37 ^о С.

9. Результаты внести в таблицу.

Занятие третье.

10. Просмотреть засеянные чашки и описать выросшие колонии. Описать типичные для кишечной палочки колонии, имеющие темно-красный или красный цвет с золотистым металлическим блеском.

11. Для установления морфологических признаков бактерий приготовить препараты «раздавленная капля» и окрашенный по методу Грама из типичных и нетипичных колоний. При микроскопировании препаратов отметить форму клеток, подвижность, наличие или отсутствие спор и отношение к окраске по Граму.

12. Результаты исследований внести в таблицу и сделать окончательный вывод о коли- титре в исследуемом материале:

Исследуемый объ-ект	Разве-дение	Помут-нение среды	Газообразо-вание среды	Под-кисление среды	Булира, Хейфеца, Кесслера	Бродиль-ный коли-титр	Типич-ность коло-ний на среде Эндо	Морфологические особенности
								Фор-ма клет-ки	споры	Подвиж-ность	Отношение к окраске по Граму
	1)… 2)… 3)… 4)…