Лабораторна робота № 4 Проби колоїдостійкості білків сироватки крові. Тимолова проба

Мета: Дослідити взаємодію сироватки крові з тимолово-вероналовим реактивом.

Теоретична частина

Тимолова проба, яка запропонована у 1944 році Маклаганом, заснована на визначенні ступеня помутніння суміші при взаємодії сироватки крові з насиченим розчином тимолу у вероналовому буфері.

Хімічна сутність тимолової проби остаточно не з'ясована. Багато авторів гадають, що проба стає позитивною при зменшенні вмісту альбумінів і збільшенні рівню β-, γ-глобулінів і пов'язаних із β-глобулінами ліпідів (ліпопротеїдів) у сироватці крові. Вважають, що помутніння суміші обумовлено взаємодією колоїдних часток тимолу і деяких крупнодисперсних білків – γ-глобулінів і γ-ліпо­протеїдів. За думкою Маклагана, ця реакція викликана утворенням глобулінотимололіпідного комплексу, що містить 40 % глобулінів, 32 % тимолу, 18 % холестерину і 10 % фосфоліпідів.

Всі відомі в даний час проби тимолового помутніння відрізняються, головним чином, засобом готування буферного розчину. Якщо в методиці Маклагана використовується тимол, то в уніфікованому методі Хуерго і Попера тимол попередньо розчиняють в етанолі й отриманий розчин додають до барбітуратового буфера.

Прилади та матеріали:

1. Тимоловий реактив. У мірну колбу на 500 мл наливають 400 мл води та при сталому перемішуванні повільно піпеткою додають 7,5 мл концентрованого робочого розчину тимолу. Носик піпетки повинен бути занурений у воду. Розчин доводять водою до мітки і ще перемішують 10 хвилин. Зберігають при кімнатній температурі. Реактив стійкий декілька місяців.

2. Розчин з молярною концентрацією барій хлориду (BaCl₂) 48 ммоль/л. Сухий шприц на 2 мл промивають дис­тильованою водою. У хімічний стакан відміряють 10 мл дистильованої води. З цієї кількості відбирають шприцом 2 мл води і вносять у флакон із BaCl₂ (не розкриваючи) і перемішують. Після повного розчинення BaCl₂ обережно розкривають флакон, додаючи в нього ту кількість води, що залишилася. Перемішують вміст флакона.

3. Розчин з молярною концентрацією еквівалентів сульфатної кислоти (H₂SO₄), 0,2 н. У мірну колбу на 100 мл вносять 50 мл дистильованої води. З флакона з кислотою піпеткою відбирають 10 мл розчину з молярною концентрацією еквівалентів H₂SO₄ 2 моль/л, вносять у колбу і доводять об’єм до мітки дис­тильованою водою, перемішують. Розчин використовують охолодженим.

4. Стандартна суспензія барій сульфату (BaSO₄). У мірний посуд на 5 мл піпеткою вносять 0,15 мл розчину BaCl₂, доводять об’єм до мітки розчином з молярною концентрацією еквівалентів H₂SO₄ 0,2 моль/л, який охолоджений до 10 ^оС.

5. Досліджувана сироватка крові.

6. Фотоелектроколориметр КФК–2.

Хід визначення за калібрувальним графіком

1. Побудова калібрувального графіка.

З розчинів сульфатної кислоти і суспензії барій сульфату готують ряд розведень, що відповідають одиницям помутніння S–H (табл. 4).

Стандартні розчини змішують у пробірці, струшують і у той же час фотометрують у кюветі з товщиною шару 5 мм проти дистильованої води за довжини хвилі 630 – 670 нм (розд. 2.1.1).

Будують калібрувальний графік в координатах: по осі ординат – екстинкція, по осі абсцис – одиниці помутніння S–H. Складають калібрувальну таблицю (стор. 48).

Таблиця 4

Склад стандартних розчинів

№ пробірки Інгредієнти, мл	1	2	3
Стандартна суспензія BaSO4	0,67	1,35	2,7
0,2 н розчин H2SO4	2,33	1,65	0,3
Одиниці помутніння (S–Н)	5	10	20

2. Визначення одиниць помутніння досліджуваної сироватки крові.

У пробірку вносять 3 мл тимолового реактиву, додають 0,05 мл сироватки крові, перемішують, витримують 30 хвилин при кімнатній температурі і фотометрують у кюветі з товщиною шару 5 мм за довжини хвилі 630 – 590 нм проти тимолового реактиву. Ступінь помутніння, що вимірюється в одиницях S–H, знаходять за ка­лібрувальним графіком. Якщо помутніння перевищує 20 одиниць S–H, то варто провести повторне визначення із сироваткою крові, яка розведена фізіологічним розчином (розчин з масовою часткою натрій хлориду 0,9 %) у співвідношенні 1:1, а результат помножити на 2.

Норма: 0 – 4 одиниці S–H.

За отриманими даними екстинкції досліджуваної сироватки знаходять ступінь помутніння S–H і роблять клініко-діагностичний висновок (стор. 49).

Примітка. Важливою умовою одержання точних даних з колоїдостійкості білка в крові є відбір крові натще.