Лабораторна робота № 12 Визначення активності α-амілази в сироватці крові. Метод Кінга
Мета: Дослідити активність α-амілази за реакцією розщеплення полісахаридів, за отриманими результатами зробити клініко-діагностичний висновок (стор. 91).
Принцип методу: Активність амілази визначають за часом, що необхідний для розщеплення крохмалю, введеного в реакційну суміш. Метод заснований на здатності крохмалю у присутності йоду забарвлюватися в синьо-фіолетовий колір.
Прилади та матеріали: водяний термостат; основний розчин йоду (розчин з молярною концентрацією еквівалентів І2 0,1 моль/л); робочий розчин йоду (готують безпосередньо перед дослідом розведенням основного розчину йоду в 15 – 20 разів дистильованою водою); розчин з масовою часткою крохмалю 0,075 %; досліджувана сироватка крові.
Хід визначення
У пробірку вносять 2 мл розчину крохмалю і вміщують у водяний термостат при температурі 37 0С, де вона знаходиться до кінця реакції. Після 2 хвилин прогрівання в пробірку вносять 0,5 мл сироватки крові, перемішують і відзначають час початку реакції.
Готують серію пробірок із 5 – 6 шт., що містять по 0,2 мл робочого розчину йоду. Кожні 2 – 5 хвилин у залежності від швидкості реакції беруть невеличкі проби – 0,1 мл (1 – 2 краплі) і вносять їх у пробірки, що містять по 0,2 мл робочого розчину йоду. Кінець реакції визначають за зникненням синьо-фіолетового забарвлення і появі жовтого. У цей момент ферментативний гідроліз крохмалю, узятого для реакції, закінчено.
Розрахунок активності α-амілази
За одиницю активності приймають кількість ферменту, що розщеплює 1,5 мг крохмалю протягом 8 хвилин. Це довільне число вибрано, щоб наблизити цей метод до інших, у яких враховується утворення сахару за його редукуючою дією.
Активність α-амілази розраховується за формулою:
,
де Аам – активність α-амілази, яка виражена в одиницях на 100 мл сироватки; 8 – час у хвилинах, необхідний для розщеплення 1,5 мг крохмалю у 0,5 мл сироватки, в якій активність амілази дорівнює 1 (одиниці); 0,5 – кількість сироватки, яку взяли для аналізу (мл); Т – час реакції в хвилинах.
Норма. У здорової людини активність α-амілази, яка визначена за даним методом, складає 90 – 163 одиниць на 100 мл сироватки.
Лабораторна робота № 13 Вплив рН середовища на активність ферментів
Мета: Дослідити вплив рН реакційного середовища на активність ферменту – α-амілази та визначити оптимум рН для дії α-амілази.
Теоретична частина: Активність ферментів залежить від рН середовища. Оптимальне значення рН для дії більшості ферментів складає 6,0 – 8,0. Винятком є шлунковий фермент пепсин, який активний при рН менше 2.
Прилади та матеріали: водяний термостат, термометр, рН-метр, розчин з молярною концентрацією калій дигідрогенфосфату 0,07 моль/л, розчин з молярною концентрацією натрій гідрогенфосфату 0,07 моль/л, розчин з масовою часткою крохмалю 0,5 %, йод у розчині з масовою часткою калій йодиду 3 %, стандартні буферні розчини, досліджувана сироватка крові.
Хід визначення
За завданням викладача готують 4 – 5 буферних розчинів із певним значенням рН, користуючись таблицею 13.
Таблиця 13
Склад стандартних буферних розчинів
|
Na2HPO4, мл |
KH2PO4, мл |
рН |
|
Na2HPO4, мл |
KH2PO4, мл |
pН |
|
0,00 |
10,0 |
4,49 |
|
6,00 |
4,00 |
6,98 |
|
0,10 |
9,90 |
4,94 |
|
7,00 |
3,00 |
7,17 |
|
0,25 |
9,75 |
5,29 |
|
8,00 |
2,00 |
7,38 |
|
0,50 |
9,50 |
5,59 |
|
9,00 |
1,00 |
7,73 |
|
1,00 |
9,00 |
5,91 |
|
9,50 |
0,50 |
8,04 |
|
2,00 |
8,00 |
6,24 |
|
9,75 |
0,25 |
8,34 |
|
3,00 |
7,00 |
6,47 |
|
9,90 |
0,10 |
8,67 |
|
4,00 |
6,00 |
6,64 |
|
10,0 |
0,00 |
9,18 |
|
5,00 |
5,00 |
6,81 |
|
|
|
|
Дві бюретки заповнюють розчином з молярною концентрацією натрій гідрогенфосфату 0,07 моль/л і розчином з молярною концентрацією калій дигідрогенфосфату 0,07 моль/л. Змішуванням різноманітних об'ємів того та іншого розчинів одержують суміші з певним значенням рН.
Точні значення рН визначають на рН-метрі або на йономірі зі скляним індикаторним електродом (розд. 2.4).
Для цієї роботи можливо використати серію стандартних буферних розчинів, попередньо визначивши значення рН на рН-метрі. Бажано підбирати розчини з таким значенням рН, щоб діапазон рН охоплював кисле, нейтральне та лужне середовище.
У пробірки вносять по 5 мл буферного розчину з певним значенням рН, 1 мл розчину з масовою часткою крохмалю 0,5 %, 1 мл розведеної в 10 разів сироватки і старанно перемішують вміст за допомогою скляної палички. Пробірки вміщують у водяний термостат, нагрітий до 37 0С, і через 3 – 5 хвилин у всі пробірки капають декілька крапель розчину йоду (розчин у пробірках забарвлюється у синій колір). Через кожні 2 – 3 хвилини проводять спостереження за зміною забарвлення. Для кожної із пробірок відзначають час, коли зникне синій колір (закінчення амілолітичного розщеплення крохмалю).
Отримані результати виражають графічно: по осі абсцис завдають значення рН дослідів, а по осі ординат – час розщеплення крохмалю при відповідних значеннях рН.
Роблять висновок про залежність активності ферменту від значення рН і визначають оптимум рН для дії α-амілази.