Лабораторна робота № 7 Визначення креатиніну в біологічних рідинах за кольоровою реакцією Яффе

Мета: Вивчити колориметричний метод кількісного визначення вмісту креатиніну в біологічних рідинах, розрахувати концентрацію креатиніну в сироватці крові та сечі, зробити клініко-діагностичний висновок (стор. 67).

Принцип методу: У результаті реакції креатиніну з пікриновою кислотою в лужному середовищі утворюється забарвлена сполука, інтенсивність забарвлення якої про­порційна концентрації креатиніну.

Прилади та матеріали: колориметр-нефелометр фотоелектричний ФЭК – 56М, досліджувана сироватка крові, досліджувана сеча.

Реактиви:

1.  розчин з масовою часткою натрій гідроксиду (NaOH) 10 % ;

2.  розчин з молярною концентрацією хлоридної кислоти (HCl) 0,1 моль/л;

3)  насичений розчин пікринової кислоти (2 г пікринової кислоти розчиняють у 100 мл гарячої (70 – 80 ⁰С) дистильованої води для осадження надлишку пікринової кислоти);

4)  основний стандартний розчин креатиніну – 8,80 ммоль/л (100 мг креатиніну розчиняють у 100 мл розчину з молярною концентрацією HCl 0,1 моль/л).

5) робочий стандартний розчин одержують розведенням основного розчину дистильованою водою в 100 разів (0,088 ммоль/л). 1 мл робочого розчину креатиніну містить 0,01 мг креатиніну.

а) Хід визначення концентрації креатиніну

в сироватці крові викладено у таблиці 9.

Таблиця 9

Вміст робочих розчинів

та хід визначення креатиніну

Інгредієнти, мл	Досліджувана проба		Стандарт­на проба			Холоста проба
Сироватка крові	2,0		–			–
Стандартний розчин креатиніну	–		2,0			–
Пікринова кислота	6,0		6,0			4,0
Перемішують, витримують 5 хвилин і вміщують на 15–20 с у киплячу водяну баню, потім центрифугують
Центрифугат	4,0		4,0		–
10 % розчин NaOH	0,2		0,2		0,2
Ретельно перемішують. Якщо після добавки лугу суміш стає каламутною внаслідок випадання фосфатів, проби слід вдруге відцентрифугувати
Дистильована вода		5,8		5,8	5,8

Через 10 хвилин проби колориметрують за довжини хвилі 540 нм (зелений світлофільтр) у кюветі з товщиною шару 20 мм (розд. 2.1.3) проти холостої проби.

Розраховують концентрацію креатиніну в сироватці крові за формулою:

ммоль/л (88 мкмоль/л),

де С – вміст креатиніну в сироватці крові; Е_досл. – екстинкція досліджуваної проби; Е_ст. – екстинкція стандартної проби;  – концентрація креатиніну в стандартній пробі, 0,088 ммоль/л.

Норма креатиніну в сироватці крові:

у жінок 0,044 – 0,097 ммоль/л (44 – 97 мкмоль/л),

у чоловіків 0,044 – 0,115 ммоль/л (44 – 115 мкмоль/л).

Б) Хід визначення вмісту креатиніну в добовій сечі

проводять відповідно таблиці 10.

Таблиця 10

Вміст робочих розчинів

Інгредієнти, мл	Досліджу-вана проба	Стандартна проба	Холоста проба
Добова сеча	0,5	–	–
Стандартний розчин креатиніну (8,80 ммоль/л)	–	0,5	–
Пікринова кислота	3,0	3,0	3,0
Ретельно струшують
10 % розчин NaOH	0,2	0,2	0,2

Проби витримують при кімнатній температурі протягом 10 хвилин. Доводять об'єм у мірній колбі дистильованою водою до 100 мл. Вимірюють екстинкцію за допомо­гою фотоелектроколориметра в кюветі з товщиною шару 20 мм проти холостої проби за довжини хвилі 540 нм (зелений світлофільтр) (розд. 2.1.3).

Розрахунок кількості креатиніну в сечі

Розраховують концентрацію креатиніну за формулою:

,

де С – концентрація креатиніну в сечі (ммоль/л); Е_досл. – екстинкція досліджуваної проби; Е_ст. – екстинкція стандартної проби;  – концентрація основного стан­дартного розчину креатиніну (8,80 ммоль/л).

Розраховують добову екскрецію креатиніну за формулою:

де С – кількість креатиніну в добовій сечі (ммоль/л); С_ст. – кількість креатиніну в стандартній пробі (8,80 ммоль/л); Е_досл. – екстинкція досліджуваної проби; Е_ст. – екстинкція стандартної проби; д – добова кількість сечі (мл); а – кількість сечі, яка взята для аналізу (0,5 мл).

Норма вмісту креатиніну в добовій сечі:

4,4 – 17,6 ммоль/доб (0,5 – 2,0 г).

Примітки. Якщо концентрація креатиніну в сироватці крові понад 0,440 ммоль/л, то сироватку розводять фізіологічним розчином. Екстинкцію вимірюють не пізніше, ніж через 20 хвилин після додавання до вмісту пробірок розчину натрій гідроксиду. Якщо величина екстинкції дос­ліджуваних проб перевищує 0,22 – 0,25, то сечу потрібно розводити з наступним урахуванням показника розведення (величину екстинкції множать на показник розведення).