2.1.2.3. Визначення кількості еритроцитів в 1 л крові

Принцип методу. У визначеному об’ємі камери Горяєва під мікроскопом підраховують клітинні елементи, а потім перераховують отриманий результат на 1 мкл чи 1 л крові. Кров заздалегідь розводять пробірковим методом, який запропонував Н. М. Ніколаєв, аби зменшити кількість клітин, що перебуватимуть в одному полі зору під мікроскопом.

Обладнання. Вата, скарифікатори, штатив з пробірками, камера Горяєва, автоматичні лічильники, покривні скельця, скляні палички, мікроскоп, піпетки, груші, дозатори, рукавички.

Реактиви

1. Спирт – 70 º розчин.

2. Натрій хлорид – 0,9 % розчин, в який додають 4 мг барвника (метиленовий синій або крезиловий синій) на 10 мл розчину.

3. Дезрозчин.

Будова камери Горяєва. У лабораторних дослідженнях користуються камерою, яка складається з товстого предметного скла прямокутної форми, яке має чотири поперечні борозни (рис. 2.14). Борозни поділяють скло на пластинки – дві бокові та середню. Середня пластинка на 0,1 мм нижча від бокових. Вона поділена поперечною борозною на дві рівні частини. На кожній частині камери вигравірувані дві сітки Горяєва. Збоку від сіток є скляні прямокутні пластинки, до яких притираються спеціальні шліфовані покривні скельця. Покривне скло накладають так, щоб воно покрило обидві бокові та середню платини. Натискаючи великими пальцями руки на краї скла, його притирають до бокових пластин, поки не утворяться райдужні кільця (кільця Ньютона). Оскільки бокові платини вищі від середньої, то між нею і покривним склом залишається щілина, яка і є камерою, в яку наливають розведену кров.

Рис. 2.14. Камера Горяєва

Нанесена сітка Горяєва квадратна, розграфлена на 225 великих квадратів – 15 по горизонталі та 15 по вертикалі. Частина великих квадратів (через два на третій) розграфлені вертикально і горизонтально на 16 малих квадратів, що чергуються з квадратами, розділеними лише горизонтальними або вертикальними лініями і з чистими квадратами без ліній. Глибина камери становить 1/10 мм, сторона малого квадрата – 1/20 мм. Отже, об’єм малого квадрата дорівнює 1/4 000 мм³. Це важливо пам’ятати для правильного розрахунку кількості еритроцитів або інших клітинних елементів в 1 мкл крові.

Хід роботи

У наперед висушену чисту конічну пробірку відмірюють 4 мл рідини для розведення еритроцитів – 3,0 % розчин натрій хлориду, який містить барвник для підфарбовування ядер лейкоцитів і для легшої диференціації клітин, що дуже важливо у разі великої кількості лейкоцитів.

Проколюють шкіру пальця. Першу краплю знімають. Капіляр промивають фізіологічним розчином, потім ретельно видувають залишки цього розчину. Набирають 0,02 мл крові, кінчик капіляра витирають сухою ваткою, капіляр опускають на дно пробірки з розчином натрій хлориду і обережно видувають. Капіляр промивають два-три рази верхнім шаром розчину, перемішують. У лабораторних обчисленнях приймають, що отримане співвідношення 1:201 дорівнює 1:200. Суміш ретельно перемішують і нею заповнюють камеру Горяєва, яка заздалегідь підготовлена.

Перед використанням камеру і шліфоване скло миють та висушують. Покривне скло притирають до камери так, щоб з’явилися райдужні ньютонівські кільця (тільки за цих умов зберігається правильний об’єм камери).

Вміст пробірки старанно перемішують, набирають капіляром чи дозатором невеликий об’єм розведеної крові і підносять її до щілини між камерою і притертим покривним склом (рис. 2.15). Розведена кров повинна заповнити камеру так, щоб уся поверхня, на якій нанесена сітка, була заповнена рідиною, і щоб рідина не затікала у борозни та не мала пухирців повітря.

Рис. 2.15. Заповнення камери Горяєва

Заповнену камеру залишають у горизонтальному положенні на 1-2 хв для осідання еритроцитів. Підраховують еритроцити під мікроскопом при малому збільшенні (об’єктив – ×8, окуляр – ×10 чи ×15) у затемненому полі зору (діафрагма прикрита, конденсатор опущений).

Еритроцити рахують у п’яти великих розграфлених (на 16 малих) квадратах (5х16 = 80 малих квадратів), які розміщені по діагоналі, оскільки розподіл клітин у камері може бути нерівномірним (рис. 2.16). Щоб результат був достовірним, треба дотримуватися відповідних правил підрахунку: в кожному квадраті необхідно враховувати ті еритроцити, які розташовані всередині квадрата, а також ті, що лежать на лівій та верхній межових лініях, якщо вони наполовину або більшою своєю частиною заходять у середину цього квадрата (рис. 2.16).

1

2

3

4

5

Рис. 2.16. Порядок підрахунку еритроцитів у великих розграфлених (на 16 малих) квадратах сітки

Розрахунок кількості еритроцитів проводять за формулою:

,

де х – кількість еритроцитів в 1 мкл крові; а – сума еритроцитів, підрахованих у певній кількості малих квадратів; с – кількість малих квадратів, у яких рахували еритроцити (п’ять великих розграфлених на 16 малих: 5 × 16 = 80; b – розведення крові, яка становить 200 раз; 4 000 – об’єм малого квадрата (оскільки об’єм малого квадрата дорівнює 1/4 000 мм³ , то, щоб перейти до об’єму 1 мм³ (1 мкл), множимо отримане значення на 4 000).

Скорочена формула:

або х = а ×10 000.

Для перерахунку кількості еритроцитів в 1 л крові, отримане значення х помножують на 10⁶/л.

Приклад. У п’яти великих квадратах (або у 80 малих) підраховано 468 еритроцитів, кров розведена у 200 разів. Кількість еритроцитів в 1 мкл становить:

Отже, в 1 мкл крові міститься 4,68 × 10⁶ еритроцитів, а в 1 л крові кількість еритроцитів буде 4,68 × 10¹².

Якщо збережено всі умови розведення, заповнення і підрахунку, то можна не користуватися поданою формулою щоразу, а до підрахованої кількості еритроцитів дописувати чотири нулі.

Контроль якості здійснюють контрольною суспензією (Ек – контроль еритроцитів), яку досліджують так, як кров донора.

Нормальні значення кількості еритроцитів у периферичній крові наведено в таблиці 2.1.

Клініко-діагностичне значення. Збільшення кількості еритроцитів в одиниці об’єму крові називається еритроцитозом. Еритроцитоз трапляється у новонароджених у перші три дні життя (у зв’язку з переходом на легеневе дихання і шкірною респірацією згущується кров), у дорослих під час сильного потовиділення, голодування, піднімання на велику висоту (завдяки посиленому продукуванню еритроцитів у кістковому мозку). Еритроцитоз характерний для еритремії, гострих інтоксикацій, ацидозів, зневоднення організму (при блювоті, проносі) тощо.

У патологічних станах розрізняють абсолютні (за рахунок реактивного подразнення еритропоезу зі збільшенням маси циркулюючих еритроцитів) та відносні (за рахунок згущення крові) еритроцитози.

Абсолютні еритроцитози спостерігаються при гіпоксичних станах: вроджених вадах серця, ревматичному мітральному стенозі, емфіземі легень, гіпертонії малого кола кровообігу, ожирінні, аденомі гіпофізу. Причиною еритроцитозу в умовах гіпоксії є стимуляція продукції еритропоетичних факторів – еритропоетину та глюкокортикостероїдів.

Відносні еритроцитози виникають за рахунок зменшення об’єму плазми під час тривалого блювання, сильних проносів, швидкого наростання набряків у шоковому стані, іноді при неврозах (так звані стрес-еритроцитози, викликані порушенням нервової регуляції і перерозподілом еритроцитів у капілярах).

Від симптоматичних еритроцитозів треба відрізняти еритремію – захворювання, яке є гемобластозом. Для еритроцитозу при еритремії характерний пухлинно-проліферативний процес у кістковому мозку (до 10,0 × 10⁶ еритроцитів в 1 мкл крові).

Зменшення кількості еритроцитів – еритроцитопенія – є одним із найважливіших показників анемії, її ступінь різний залежно від виду та важкості. Від істинних анемій слід відрізняти гідремію, що пов’язана зі збільшенням об’єму плазми (у разі сходження набряків тощо). Причинами анемій можуть бути дефіцит в організмі заліза, вітаміну В₁₂, крововтрата, гемоліз, гемоглобінопатії, гіпо- й апластичні процеси у кістковому мозку (жирове переродження). При залізодефіцитних анеміях кількість еритроцитів зменшується до 3,0–2,5 × 10⁶/мкл крові, при перніціозній (В₁₂-дефіцитній) – до 1,0–1,5 × 10⁶/мкл, при апластичній – до 0,6 × 10⁶/мкл.