2.2.3.5. Кількісне визначення термолабільного гемоглобіну

Принцип методу. У разі одногодинної інкубації гемолізату еритроцитів периферичної крові при +55 °С термолабільний гемоглобін денатурує і випадає в осад, а термостабільний гемоглобін залишається в розчині.

Обладнання. Вата, скарифікатори, штатив з пробірками, піпетки, груші, дозатори, годинник, центрифуга, центрифужні пробірки, пробірки типу Еппендорф, рукавички, водяна баня, спектрофотометр чи фотоелектроколориметр.

Реактиви

1. Натрій цитрат – 5 % розчин або будь-який інший антикоагулянт.

2. Фізіологічний розчин – 0,85 % розчин натрій хлориду.

3. Фосфатний буфер – 0,1 М розчин, рН 7,4: для приготування буфера готують два розчини солей натрій фосфату. Розчин А – 7,8 г однозаміщеного натрій фосфату (NаН₂РО₄ × Н₂О) доводять дистильованою водою до 500 мл; розчин В – 7,1 г двозаміщеного натрій фосфату (Nа₂НРО₄) доводять дистильованою водою до 500 мл. Змішують 19,2 мл розчину “А” і 80,8 мл розчину “В”, рН розчину доводять до 7,4.

4. Аміак – 0,04 % розчин (NН₄ОН): 0,40 мл 25 % аміаку доводять до 25 мл дистильованою водою.

Хід роботи

Готують цитратну кров: до 0,1 мл крові додають 0,01 мл 5,0 % розчину натрій цитрату. Кров з антикоагулянтом переносять у пробірки типу Еппендорф. Еритроцити відділяють від плазми крові шляхом центрифугування цитратної крові в пробірках типу Еппендорф при 3 000 об/хв протягом 5 хв. Верхній шар плазми відсмоктують за допомогою шприца з довгою голкою і виливають.

Еритроцити з 0,1 мл цитратної крові відмивають двічі у 1,0 мл фізіологічного розчину. До осаду відмитих еритроцитів додають 0,5 мл дистильованої води і перемішують. Додають 0,5 мл 0,1 М фосфатного буфера (рН 7,4) і перемішують. Центрифугують 10 хв при 3 000 об/хв. Із супернатанту відбирають 0,2 мл забуференого гемолізату і вносять у пробірку з 3,4 мл 0,04 % розчину аміаку. Після перемішування визначають оптичну густину на спектрофотометрі у 10 мм кюветі при довжині хвилі 540 нм. Контрольним розчином є аміак. Дані цієї екстинкції (Е₁) до інкубації приймають за 100 % гемоглобіну.

Забуферений гемолізат у кількості 0,5 мл інкубують у водяній бані при температурі +55 °С протягом 1 год, після чого центрифугують 10 хв при 3 000 об/хв. Із супернатанту відбирають 0,2 мл і вносять його у пробірку з 3,4 мл 0,04 % розчину аміаку. При довжині хвилі 540 нм визначають екстинкцію розчину Е₂. Дані цієї екстинкції відповідають термостабільному гемоглобіну. Вміст термостабільного гемоглобіну вираховують за формулою:

де Х – відсоток термостабільного гемоглобіну (у нормі, на його частку припадає 90–92 % і більше). Процент термолабільної фракції становить 100 % – х.

2.2.3.6. Визначення вмісту глікозильованого гемоглобіну

Принцип методу.

Обладнання. Штатив з пробірками, піпетки, груші, дозатори, годинник, центрифуга, центрифужні пробірки, пробірки типу Еппендорф, рукавички, спектрофотометр чи фотоелектроколориметр.

Реактиви

1. Щавлева кислота – 0,3 М розчин (молекулярна маса – 90,04): зважують 27 г і доводять об’єм розчину до 1 л.

2. Тіобарбітурова кислота – 0,05 М розчин (молекулярна маса – 144,2): 720 мг тіобарбітурової кислоти розчиняють у дистильованій воді і доводять об’єм до 100 мл.

3. Трихлороцтова кислота – 40% розчин: 40 г трихлороцтової кислоти розчиняють у дистильованій воді і доводять об’єм до 100 мл.

Хід роботи

Для приготування проби необхідно 3–5 мл гепаринізованої венозної крові, яку центрифугують 15 хв при 3 000 об/хв. Відбирають плазму, а еритроцитарну масу тричі промивають фізіологічним розчином, центрифугуючи протягом 5 хв при 3 000 об/хв. Відмиті еритроцити гемолізують дистильованою водою у співвідношені 1:3 і центрифугують 15 хв при 18 000 об/хв. Другий етап досліду – одержання супернатанту. Для цього до 2 мл еритроцитарної маси додають 1 мл 0,03 М розчину щавлевої кислоти. Потім суміш інкубують при 100 С протягом 1 год, охолоджують і додають 1 мл 40 % розчину трихлороцтової кислоти, обов’язково перемішують і центрифугують 10 хв при 3 000 об/хв.

Далі 2 мл супернатанту змішують з 0,5 мл 0,05 М розчину тіобарбітурової кислоти і суміш інкубують при 40 С протягом 40 хв. Через 20 хв після закінчення інкубації визначають оптичну густину в 10 мм кюветах проти дистильованої води при довжині хвилі 443 нм. Оптична густина 0,029 відповідає 1 % глікозильованого гемоглобіну.