2.1.2.8. Техніка виготовлення мазків крові
Принцип методу. Принцип усіх запропонованих фарбувань ґрунтується передусім на хімічній спорідненості різних складових частин клітини з певним барвником, переважно з аніліновими фарбами. Ядро, яке містить у великій кількості нуклеїнові кислоти, зв’язує основні фарби, тобто є базофільним. Цитоплазма одних кров’яних клітин (наприклад, ортохромні нормобласти, еритроцити) оксифільна, тобто поглинає здебільшого кислі фарби, інших (молоді форми, лімфоцити) – базофільна. Вкраплення в цитоплазму мають різне забарвлення залежно від спорідненості з тим чи іншим барвником. Якщо вони сприймають обидва барвники одночасно, то зафарбовуються метахроматично.
Обладнання. Вата, скарифікатори, предметні скельця, шліфоване скло, скляні палички, піпетки, груші, дозатори, рукавички, кювета для забарвлення препаратів, термометр.
Реактиви
1. Спирт – 70 º розчин.
2. Основний барвник Романовського-Гімза.
3. Основний барвник Май-Грюнвальда.
4. Суміш Нікіфорова.
5. Метиловий спирт.
6. Дезрозчин.
Хід роботи
Приготування мазків. На одному кінці предметного скла приклеюють наклейку й олівцем пишуть прізвище особи, кров якої досліджують, і дату. Краєм добре вимитого знежиреного предметного скла торкаються до краплі крові на місці уколу. Мазок роблять шліфованим склом, поставивши його під кутом 45° до предметного скла (рис. 2.18). Підвівши скло до краплі, чекають поки кров розпливеться вздовж ребра, потім швидким легким рухом проводять шліфоване скло вперед, не відриваючи його від предметного раніше, ніж використається вся крапля. Правильно зроблений мазок має жовтуватий колір (тонкий); не досягає країв скла і закінчується характерним слідом – вусами. Отримані мазки висушують на повітрі.
Рис. 2.18. Основні етапи виготовлення мазків крові
Фіксування мазків. Сухі мазки фіксують, а згодом висушують. Найкраще фіксували мазки в абсолютному метиловому спирті (5–15 хв) або в суміші Нікіфорова, що складається з рівних частин абсолютного етилового алкоголю й ефіру (30–45 хв).
Фарбування мазків. До основних гематологічних барвників належать метиленовий синій і його похідні – азур І (метиленовий азуровий) та азур II (суміш рівних частин азуру І і метиленового синього), до кислих – водорозчинний жовтий еозин.
Методи забарвлення:
1. Забарвлення за Романовським-Ґімза.
Фарба Романовського-Ґімза заводського приготування має такий склад: азур II – 3 г, водорозчинний жовтий еозин – 0,8 г, метиловий спирт – 250 мл і гліцерин – 250 мл. Цей метод широко застосовують для вивчення лейкоцитів периферичної крові, однак він має обмеження при вивченні тонкої структури мієлокаріоцитів, оскільки не дає змоги добре виявити нейтрофільну зернистість цитоплазми.
Робочий розчин фарби готують з розрахунку 2–3 краплі готової фарби на 1 мл дистильованої води. На фіксовані мазки наливають фарбу якомога вищим шаром (2 мл фарби на один мазок крові), забарвлюють 35–45 хв. Потім мазки промивають водою і висушують на повітрі.
2. Комбіноване забарвлення Май-Грюнвальда-Романовського-Ґімза за Папенгеймом.
На нефіксований висушений мазок піпеткою капають 2 мл готового розчину фарби-фіксатора Май-Грюнвальда, до складу якої входить розчин еозину та метиленового синього в метиловому спирті. Через 3–7 хв до фарби, яка покриває мазок, додають рівну (приблизно 2 мл) кількість дистильованої води і старанно перемішують фарбу на мазку, послідовно набираючи і видуваючи суміш через тонку піпетку. Коли мазок набуде рожевого відтінку (приблизно через 1 хв), барвник з мазка зливають і, не висушуючи мазок, дофарбовують протягом 8–15 хв свіжоприготованим водним розчином фарби Романовського (1 крапля фарби на 1 мл Н2О). Потім фарбу зливають, а мазок промивають водопровідною водою, висушують, мікроскопують. Цей метод вважається найкращим, особливо для диференціювання зернистості поліморфноядерних лейкоцитів.