2.2.1.4. Визначення резистентності еритроцитів до кислотного гемолітика
Принцип методу. При додаванні до суспензії еритроцитів 0,004 н. розчину хлоридної кислоти відбувається повільний гемоліз еритроцитів. Спектрофотометрично реєструють кінетику гемолізу. Оскільки при довжині хвилі 630 нм майже не вловлюється зміна кольору гемоглобіну, екстинкція у разі фотометрування залежить лише від концентрації завислих у розчині еритроцитів. Постійне зменшення екстинкції, яке спостерігаємо через 30-секундні інтервали, викликане поступовим руйнуванням еритроцитів, причому руйнуються спочатку ті клітини, резистентність яких до хлоридної кислоти слабша.
Обладнання. Вата, скарифікатори, капіляр, штатив з пробірками, фільтрувальний папір, пробірки типу Еппендорф, скляні палички, піпетки, груші, дозатори, рукавички, фотоелектроколориметр, кювети, секундомір.
Реактиви
1. Натрій хлорид – 0,85 % розчин.
2. Хлоридна кислота – 0,004 н. розчин, приготовлений на 0,85 % розчині натрій хлориду.
Хід роботи
Кров з пальця пацієнта (або ж кров з антикоагулянтом з пробірки) розводять 0,85 % розчином NаСl приблизно у 1 000 разів – отримують робочу суспензію еритроцитів. Розведену кров фотометрують на фотоелектроколориметрі при довжині хвилі 630 нм. Екстинкція розведеної крові повинна становити 0,700 (якщо екстинкція є вищою 0,700, то кров додатково розводять фізіологічним розчином і знову фотометрують). Такий розчин є робочим, його можна використовувати протягом 3–4 год (за кімнатної температури) для проведення аналізу.
Роботу проводять у термостатованій кюветі для підтримання сталої температури, а саме 24 ºС. У кювету вносять 1,5 мл робочої суспензії еритроцитів і додають 1,5 мл 0,004 н. розчину НС1, приготовленого на 0,85 % розчині натрій хлориду. Точно через 30 с (час фіксують за допомогою секундоміра) роблять перше визначення екстинкції при довжині хвилі 630 нм (червоний світлофільтр). У контрольну кювету наливають 1,5 мл 0,85 % розчину натрій хлориду і додають 1,5 мл 0,004 н розчину НСl у 0,85 % розчині NаС1. Потім кожні 30 с протягом 7−10 хв визначають екстинкцію, поки її значення не перестане зменшуватися.
Зниження екстинкції відображає почерговість залучення до гемолізу еритроцитів зі зростаючою стійкістю. Це дає змогу розрізняти еритроцити за їхньою індивідуальною стійкістю.
В описаних умовах значення екстинкції починає зменшуватися через 1,0–1,5 хв від моменту внесення гемолітика (0,004 н. хлоридної кислоти). Отже, зміни екстинкції, що передують цьому, очевидно, пов’язані із передгемолізними перетвореннями еритроцитів (сферуляція).
Під час спектрофотометричної реєстрації кінетики гемолізу з отриманого ряду екстинкцій можна обчислити процентний розподіл еритроцитів за групами стійкості. У таблиці 2.3 наведено приклад розрахунку.
Таблиця 2.3
Кінетика гемолізу еритроцитів
Час гемолізу, хв |
Екстинція, Е630 |
Різниця середніх екстинцій, ΔЕ |
Розпад еритроцитів, % |
0,5 |
0,420 |
0,007 |
– |
1,0 |
0,413 |
0,005 |
– |
1,5 |
0,408 |
0,004 |
– |
2,0 |
0,402 |
00,02 |
0,6 |
2,5 |
0,400 |
0,019 |
5,3 |
3,0 |
0,381 |
0,070 |
19,5 |
3,5 |
0,311 |
0,082 |
22,8 |
4,0 |
0,229 |
0,062 |
17,3 |
4,5 |
0,167 |
0,047 |
13,1 |
5,0 |
0,120 |
0,031 |
8,6 |
5,5 |
0,089 |
0,022 |
6,1 |
6,0 |
0,067 |
0,013 |
3,6 |
6,5 |
0,054 |
0,008 |
2,8 |
7,0 |
0,046 |
0,003 |
0,8 |
7,5 |
0,043 |
0,000 |
|
8,0 |
0,043 |
|
|
Подана у таблиці різниця екстинкцій ΔЕ між сусідніми значеннями відображає кількість еритроцитів, що розпалися за час, який минув між двома реєстраціями екстинкції (у нашому випадку 30 с).
Варто зазначити, що на другій хвилині фіксують мінімальне ΔЕ, тобто процес зміни екстинкції за рахунок сферуляції у цей момент сповільнюється.
Зміни екстинкції, що були викликані передгемолітичними змінами форми еритроцитів, обмежені квадратними дужками. Відразу після того починають розпадатися найменш стійкі еритроцити, і ΔЕ знову зростає. Подальше зменшення екстинкції пов’язане зі зменшенням кількості еритроцитів у досліджуваній пробі. Воно триває доти, доки не відбудеться гемоліз останніх еритроцитів. Це реєструють по тому, що екстинкція перестає змінюватися.
Однак Е630 не дорівнює нулю, що пояснюється поглинанням світла солянокислим гематином, у який перетворився гемоглобін.
Різницю між Е630 на початку гемолізу (Е630 = 0,420) і Е630 після закінчення гемолізу (Е630 = 0,043) приймають за 100 %.
У нашому випадку:
0,420 – 0,043 = 0,359
0,359 = 100 %
Далі за пропорцією:
0,359 – 100 %
0,002 – Х
Такі обчислення виконують для кожного значення зі стовпця ΔЕ і заповнюють четверту графу таблиці (% Е) (табл. 2.3). Значення % Е відтворює відсоток еритроцитів даної групи стійкості. Цим досягається незалежність результатів від індивідуальних коливань кількості еритроцитів і кількості гемоглобіну.
Процентний розподіл еритроцитів за стійкістю до кислотного гемолітика зручно зображати кривою залежності % Е від часу гемолізу – ця крива називається еритрограмою. Значення резистентності еритроцитів до кислотного гемолітика наносять на міліметровий папір. На осі абсцис з дотриманням однакових інтервалів рівномірно відкладають значення часу гемолізу еритроцитів (у хв), на осі ординат – відповідні їм значення розподілу еритроцитів (у %, з табл. 2.3). Наносять середнє значення екстинкції з декількох визначень і отримані точки сполучають лінією.
Нормальні значення. Нормальна еритрограма при використанні гемолітика 0,004 н. НС1 у практично здорових дорослих людей характеризується стрімким підйомом кривої після другої хвилини з максимумом до 3,5 хв та поступовим повільним зниженням, і досягненням нульової позначки до 7,5 хв. Криву можна розділити на три відрізки.
1. Відрізок від 1,5 до 3 хв – еритроцити зі зниженою стійкістю віком понад 90 днів (у нормі – це 20–25 % всіх клітин).
2. Відрізок від 3,5 до 4,5 хв відповідає середньостійким еритроцитам у віці 30–90 днів (у нормі 45–50 % всіх клітин).
3. Відрізок від 5,0 до 7,5 хв відповідає підвищеній стійкості еритроцитів. Це молоді еритроцити віком до 25–30 днів (у нормі 20–25 % всіх клітин).
Клініко-діагностичне значення. У клініці еритрограма дає змогу визначити стан червоної крові. У новонароджених дітей еритрограма зсунута праворуч, що свідчить про наявність більш резистентних молодих еритроцитів.
При патологічних станах можуть з’являтися відрізки високостійких еритроцитів понад 7,5 хв, і відрізки низькостійких еритроцитів – нижче 1,5 хв. Розширення еритрограми праворуч з нормально розташованим максимумом і її кінцем викликано збільшенням кількості молодих еритроцитів і свідчить про наявність регенераторного процесу.
Розширення еритрограми із зсунутим праворуч максимумом і нормальним або зсунутим праворуч її кінцем свідчить про сильну регенерацію при значній анемії (гостра постгеморагічна анемія). Тривала затримка еритрограми із зсувом кінця до 12–14 хв буває при макроцитних анеміях печінкового походження. Розширення і зсув кінця еритрограми праворуч з появою двох або більше максимумів буває при перніціозних анеміях і лейкозах.
Зсув еритрограми та її максимуму ліворуч свідчить про появу еритроцитів зі зниженою стійкістю і трапляється при інфекційних захворюваннях та інтоксикації. Якщо в цьому випадку зсувається ліворуч і кінець еритрограми, це означає, що відбувається пригнічення розвитку еритропоезу (апластичні стани).
Поява великої кількості малостійких еритроцитів (при отруєнні гемолітичними отрутами) характеризується підвищенням кривої у відрізку між 0,5–1,5 хв. Гемолітичні анемії характеризуються низькими, розширеними праворуч кривими з кількома максимумами. Отже, дослідження розподілу еритроцитів за стійкістю є відображенням їхнього фізіологічного стану.