Лекция № 27 (2 часа) Тема «Трансплантация эмбрионов коров»

1. Вопросы лекции

1.1. Отбор доноров

1.2. Суперовуляция

1.3. Синхронизация половых циклов доноров и реципиентов

1.4. Осеменение коров доноров

1.5. Извлечение и оценка эмбриона

1.6. Пересадка эмбрионов реципиентам

2 Литература

2.1 Основная

2.1.1 А.П. Студенцов, в.С. Шипилов, в.Я. Никитин, м.Г. Миролюбов.

Ветеринарное акушерство, гинекология и биотехника размножения./ Под ред. В. Я. Никитина, М.Г. Миролюбова. Учеб. для студ. высш. учеб. завед. -7 -е изд.. перераб. и дои. - М.: Колос, 2000. - 495 с.

2.1.2 В.Я. Никитин, М.Г. Миролюбов, В.П. ГончаровДЗ.В. Храмцов. Практикум по акушерству, гинекологии и биотехнике размножения животных. Учеб. и учеб пособие для студ. высш. учеб. завед. - М.: КолосС, 2004. - 208 с.

2.2 Дополнительная

2.2.1 Н.Н. Михайлов, Г.В. Паршутин, В.П. Гончаров и др. Акушерство, гине­кология и искусственное осеменение с.-х. животных. Под ред. Н.Н. Михайлова.-М: Агропромиздат, 1990.- 527с.

2.2.2 В.К. Пономарев. Ветеринарное акушерство и гинекология (цикл лекций). Учебное пособие для вузов. - Оренбург: Издательство «1МЕХТ», 1997. -176 с.

3. Краткое содержание вопросов

3.1. В большинстве случаев в качестве коров-доноров отбирают матерей потенциальных племенных быков. Благодаря этому обеспечивается высокий селекционный дифференциал. Оценка и отбор коров-доноров, выделенных в группу матерей быков, проводят в два этапа. На первом этапе племенная ценность донора оценивается по главным признакам молочного скота - по уровню молочной продукции и жирномолочности. На втором этапе, когда отобраны доноры с высокой племенной ценностью по главным признакам, число признаков в зависимости от цели селекции расширяется. К ним относят форму вымени и сосков, свойства молокоотдачи, резистентность, крепость костяка и копыт, тип и воспроизводительные качества.

Нужно иметь в виду, что оценка коровы-донора по родословной и собственной продуктивности является не окончательной, так как в этом случае не учитывается эффект расщепления и рекомбинации генов. Поэтому окончательно оценивать корову-донора можно только при получении и оценке ее потомства.

Высокие затраты на получение телят путем трансплантации эмбрионов обусловливают необходимость отбирать таких доноров, от которых регулярно можно получать большое количество эмбрионов. Предпочтение следует отдавать коровам, сохранившим в течение трех отелов стабильную воспроизводительную способность. Исследованиями [14] установлено, что потенциальные коровы-доноры с хорошими и устойчивыми воспроизводительными способностями отличаются предрасположенностью к воспроизводству эмбрионов, которые можно регулярно получать через каждые два месяца.

3.2. Важным звеном в современной биотехнологии трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота является гормональное вызывание суперовуляции у коров-доноров.

Суперовуляция - состояние, вызванное гормонами, когда в яичниках животных развивается и овулирует в несколько раз больше яйцеклеток. В зависимости от вида число овулирующих яйцеклеток может быть увеличено в 3 - 8 и даже в 50 раз. С помощью этого приема становится возможным получение большего количества эмбрионов от лучших по продуктивности коров.

В группу доноров переводят только тех коров, которые положительно реагируют на введение гормонов. Для вызывания суперовуляции у крупного рогатого скота используются гонадотропные препараты (гонадотропин сыворотки жеребых кобыл - ГСЖК и фолликулостимулирующий гормон - ФСГ - гипофиза животных), для синхронизации половых циклов - аналоги простагландина Ф2-альфа (эстрофан, магэстрофан, клопростенол, суперфан, ремофан, клатрапростин, эстуфалан и др.). [2,3]. Этот способ, как показывает практика, позволяет вызвать суперовуляцию примерно у 70% коров.

Одним из существенных недостатков этого способа суперовуляции является крайне высокая степень вариабельности числа овуляций, даже при использовании одной и той же концентрации гонадотропина СЖК. Она составляет от 0 до 50 овуляций на одну корову-донора. Оптимальным результатом суперовуляции является выход из яичника в воронку яйцепровода 10-20 яйцеклеток.

Подытоживая результаты исследований [32], пришел к выводу, что на инъекции гонадотропинов 25-35% коров-доноров не реагируют, а у положительно реагирующих коров (3 и более овуляций) вариабельность реакции яичника настолько велика, что становится невозможным надежное планирование программы пересадки эмбрионов. Некоторые [1,2] считают, что с учетом имеющейся изменчивости лишь половина коров, реагирующих на введение гонадотропинов, может дать 4-5 эмбрионов, пригодных для трансплантации. Следовательно, в основном эмбрионы можно получить менее чем от половины первоначально тщательно отобранных потенциальных коров-доноров.

По современному представлению реакция коров на суперовуляцию в значительной степени определяется количеством и качеством фолликулов яичников во время их стимуляции гонадотропинами. Экспериментально было доказано [3,16], что во время суперовуляции для получения хорошей реакции необходимо наличие определенного количества малых антральных фолликулов, чувствительных к гонадотропной стимуляции. Недостаток таких фолликулов, или напротив, наличие больших по размеру фолликулов снижают уровень реакции или она вообще отсутствует. Это может свидетельствовать об интраовариальном регулировании процесса суперовуляции. Поскольку фолликулы растут асинхронно, то в каждый период инъекция гонадотропинов будет оптимальной лишь для ограниченного числа фолликулов.

3.3. Синхронность проявления эструса между донором и реципиентом - важнейшее условие высокой приживляемости эмбрионов. Для синхронизации охоты используют простагландин ПГФ2-альфа или его синтетические аналоги (эстрофан, магэстрофан, ремофан, клопростенол, клатрапростин, суперфан, эстуфалан и др.).

По технологии трансплантации на каждого донора следует подготавливать не менее 5 реципиентов, причем день охоты реципиента должен совпадать с днем первого осеменения суперовулирующего донора. В случае использования в технологии трансплантации постоянных доноров (проверенных на гормональную обработку и имевших стабильный выход качественных эмбрионов) число реципиентов можно увеличить до 10.

Перед гормональной обработкой животных исследуют ректально (определяют размеры и форму яичников, наличие и выраженность желтого тела). Лютеиновая фаза цикла соответствует оптимальному времени для инъекции препаратов. Простагландины вводят внутримышечно в дозах, указанных в наставлениях по их применению. Как правило, животные приходят в охоту через 48-72 часа после инъекции препарата. Не пришедших в охоту животных обрабатывают повторно через 10-11 дней с момента первого введения ПГФ2-альфа. Двукратное введение препарата (в любую фазу полового цикла) с 10-ти дневным интервалом эффективно использовать на большом поголовье доноров и реципиентов, так как это способствует увеличению числа животных, проявивших признаки половой охоты, и снижает трудоемкость операций обслуживающего персонала.

Эффективен способ синхронизации эструса у доноров и реципиентов путем комплексного использования в лютеиновой фазе полового цикла инъекций гонадотропина с простагландином Ф2-α и гонадотропин рилизинг-гормоном. Животных, имеющих хорошо выраженное желтое тело, обрабатывают ФСГ-супер в общей дозе 10 Арм.ед. для телок и 15 Арм.ед. для коров двукратно по 5-7,5 Арм.ед. через 12 часов, на следующий день однократно инъецируют эстрофан по 500 мкг, а через 60 часов от момента введения эстрофана дополнительно сурфагон по 25 мкг. Половая охота у животных проявляется на 2-3 сутки после введения простагландина.

Следует учитывать, что данные обработки осуществляются не параллельно: доноров обрабатывают за 15 дней до начала стимулирования суперовуляции, а реципиентов – на второй день после начала стимулирования суперовуляции у доноров.

3.4. Результаты суперовуляции определяются эффективным осеменением коров-доноров. Проблема оплодотворения яйцеклеток и получения биологически полноценных эмбрионов все ещё остается открытой. Как показывают результаты исследований [10], только 60-65% эмбрионов пригодны для трансплантации, остальные яйцеклетки, образовавшиеся в результате гормональной обработки гонадотропинами, оказываются либо неоплодотворенными, либо после оплодотворения отстают в развитии или дегенерируют.

Для искусственного осеменения коров-доноров необходимо использовать сперму только выдающихся быков-производителей, достоверно оцененных по качеству потомства. Как отмечалось, надежным критерием наследственных качеств быка служит коэффициент повторяемости, т.е. коэффициент регрессии будущих дочерей быка на число фактически имеющихся дочерей. Если генетическое превосходство дочерей быка, выраженное величиной отклонения от сверстниц, умножить на коэффициент повторяемости, то полученная величина будет характеризовать генетическое превосходство будущих дочерей быка, или предсказанную разность. Предсказанная разность является одним из наиболее объективных качеств быка, разработанных в современной селекции молочного скота.

Для искусственного осеменения коров-доноров следует использовать, как правило, сперму производителей 1-й племенной категории, т.е. таких, племенная ценность которых превышает среднюю популяционную величину на два стандартных отклонения. В этом случае существенно повышаются темпы селекции и улучшается племенная ценность новой генерации.

Требования к оценке оплодотворяющей способности спермы быков, предназначенной для осеменения коров-доноров, должна быть значительно выше, чем при оплодотворении остальных коров.

Эффективность искусственного осеменения коров-доноров в суперовулирующую охоту во многом зависит и от правильности выбора оптимального времени для осеменения коров с учетом таких особенностей эструса, как проявление течки, ее интенсивность и длительность, общая реакция возбуждения, охоты и овуляции, строгого соблюдения ветеринарно-санитарных требований при выполнении работ.

3.5. Извлечение и оценка эмбрионов.

Эффективность метода трансплантации во многом определяется способом извлечения эмбрионов. Оплодотворенные яйцеклетки от суперовулированных коров-доноров могут быть извлечены тремя способами: после убоя коровы-донора; хирургическим; нехирургическим.

Извлечение эмбриона после убоя коровы-донора. Самым простым и надежным способом извлечения эмбрионов является убой коровы-донора. Этот способ практиковался только на первых этапах освоения метода трансплантации. В настоящее время из-за потери генетически ценной коровы-донора он не используется.

Извлечение эмбриона хирургическим способом. Важным моментом, обеспечивающим эффективность извлечения эмбрионов, является определение стадии их развития и места положения в половых путях коровы-донора. Для трансплантации рекомендуется использовать бластоцисты, поэтому эмбрионы извлекают между 7-8-ми сутками после первого искусственного осеменения. Имеется несколько способов хирургического извлечения эмбрионов: разрез верхнего свода влагалища, лапаротомия по белой линии живота и лапаротомия в области голодной ямки.

Хирургический способ извлечения эмбрионов является трудоемким, дорогостоящим и, что особенно важно, им нельзя пользоваться многократно. В настоящее время хирургический способ извлечения применяется в редких случаях, главным образом в научных целях.

Извлечение эмбрионов нехирургическим способом. Основное преимущество нехирургического способа извлечения эмбрионов заключается в простоте манипуляций. Для этого не требуется специального операционного помещения. Эмбрионы можно извлекать непосредственно в производственных условиях. Он основан на введении в матку особого зонда по естественному каналу. В среднем при суперовуляции от донора можно получить от 5 до 7 эмбрионов. С селекционной точки зрения, при правильном применении нехирургического способа воспроизводительная способность доноров не нарушается, что позволяет многократно использовать генетически ценных коров-доноров для получения от них большого числа потомков.

3.6. В качестве реципиентов используются телки случного возраста (16-18 месяцев) не представляющие племенной ценности, живой массой 380-400 кг.Не рекомендуется использовать телок с низкой живой массой.

В качестве реципиента отбирают гинекологически здоровых коров и телок после двух-трех нормальных половых циклов. Для отбора реципиентов основным показателем является отсутствие гинекологических отклонений, а продуктивные, племенные и породные качества большой роли не играют. В среднем на каждого донора отбирают 5-6 реципиентов. Большинство специалистов считает, что в качестве реципиентов наиболее пригодны полновозрастные телки с хорошими племенными кондициями.

Реципиенты должны быть клинически здоровы, внутренние и наружные половые органы хорошо развиты, половой цикл должен соответствовать физиологическим параметрам. При ректальном исследовании матка и яичники реципиента должны находиться в тазовой полости. Шейка матки должна быть четко выражена, длиной 7-12 см, диаметром 2,5-3,0 см. Длина рогов матки от 20 до 35 см. Яичники должны иметь округлую или овальную форму, плотную консистенцию, размер 3х2 см у коров и 2,0х1,5 см у телок.

Исследованиями выявлена [27,29] зависимость приживляемости зародышей от морфофункционального состояния органов воспроизведения реципиентов. У телок-реципиентов с нормально развитой половой системой уровень стельности в среднем составляет 57%, в то время как при отклонениях в развитии половой системы - 20%.

При отборе потенциальных реципиентов следует также учитывать параметры половой цикличности. В качестве реципиентов следует использовать телок с продолжительностью полового цикла 19-22 дня, поскольку у животных с менее (16-18) или более (23-26дней) продолжительным циклом отмечено достоверное снижение приживляемости зародышей на 15-20%.

Важным условием высокой приживляемости эмбрионов является синхронность в проявлении эструса у донора и реципиента, а также своевременное и квалифицированное выявление животных в охоте. Наиболее результативным (по приживляемости эмбрионов - 58%) является синхронное проявление охоты у донора и реципиента по времени с разностью  12 часов. При этом наблюдение за поведением животных следует проводить 3 раза в сутки: утром, днем и вечером по 1 часу. Это позволяет выявить до 90-95% реципиентов в охоте.

При отборе потенциальных реципиентов для трансплантации существенное значение имеет определение качества желтого тела животного. Если на яичнике реципиента пальпируется желтое тело отличного качества (размер 1,0-1,5 см, выступает над поверхностью яичника, имеет грибовидную форму) или хорошего качества (размер 0,7-1,0 см, округлая или грибовидная форма), то уровень приживляемости зародышей составляет 53-57%. При удовлетворительном желтом теле (размер 0,5 см, округлая форма) уровень стельности находится в пределах 28-30%. Не рекомендуется использовать для пересадки эмбриона реципиента, на яичниках которого имеется одновременно желтое тело и фолликул до 1,0 см.

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

«ОРЕНБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»