Семинар № 11 Тема «Разбавление и хранение спермы»

Цель занятия: изучить состав основных сред для разбавления спермы, методы их приготовления и применения для хранения при различных температурных режимах

Материалы и оборудование: сперма животных, колбы, измерительные цилиндры, микроскопы, пинцеты, скальпели, фильтровальная бумага, водяная баня, дистиллированная вода, компоненты сред.

Разбавители спермы, их назначение

Во время эякуляции к содержимому эпидидимиса примешиваются секреты придаточных половых же­лез. Они изменяют рН среды, насыщают плазму элек­тролитами (соли натрия, калия, магния); последние вызывают разрушение липопротеидного покрова спер­миев. Отмеченные сдвиги обусловливают переход спермиев из анабиоза в активное состояние; это, в свою очередь, приводит к быстрой их гибели.

Непосредственными причинами сокращения сро­ка жизни спермиев вне организма являются:

& истощение источников энергии в спермальной плазме и самих спермиях;

& интоксикация продуктами жизнедеятельности спермиев;

& разрушение липопротеидного покрова, набуха­ние мембран и снятие электрического заряда;

& отрицательное действие находящихся в сперме и размножающихся в ней микроорганизмов;

& температурные перепады.

Следовательно, для продления срока жизни спер­миев во внешней среде требуется:

& уменьшить активность спермиев;

& обеспечить их дополнительными источниками энергии;

& защитить мембрану спермия от разрушения;

& предотвратить накопление токсических про­дуктов метаболизма;

& блокировать размножение находящихся в сперме микроорганизмов;

& повысить устойчивость спермиев к температур­ным перепадам и криогенным воздействиям.

Это достигается применением специальных раз­бавителей.

Помимо защитных функций, разбавление спер­мы облегчает дробление эякулята на порции (спермо-дозы). Это особенно существенно для животных с ма­точным типом естественного осеменения (свиньи, ло­шади), поскольку спермодоза наряду с нормативным числом подвижных спермиев должна быть достаточно объемной.

К современным разбавителям предъявляются следующие требования:

& он должен быть изотоничным спермиям дан­ного вида животных и поддерживать опти­мальное осмотическое давление в течение все­го срока хранения спермы;

& обладать буферной способностью, т.е. противо­стоять сдвигам рН как в кислую, так и в ще­лочную сторону;

& обеспечивать спермиям источниками энергии для их жизнедеятельности в аэробных и ана­эробных условиях;

& поддерживать определенное соотношение электролитов и неэлектролитов;

& защищать спермин от холодового шока в диа­пазоне плюсовых температур;

& предохранять спермин от повреждений в про­цессе замораживания-оттаивания; Ъ обладать антибактериальными свойствами.

Компоненты синтетических сред

Применяемые в настоящее время разбавители спермы сельскохозяйственных животных относятся к синтетическим средам.

Синтетическая среда обычно состоит из трех и более компонентов. В состав большинства из них вхо­дят:

Сахара (глюкоза, лактоза) — служат источником энергии для спермиев. Помимо этого, они уча­ствуют в поддержании осмотического давления, понижают электропроводность среды, предохра­няют спермин от потерь электрического заряда. С желтком куриного яйца образуют биокомплек­сы, защищающие мембрану спермиев от повреж­дений при охлаждении.

Цитрат натрия. Создает буферность среды, нейтра­лизует конечные продукты жизнедеятельности спермиев; связывая ионы кальция и тяжелых металлов, обеспечивает снижение их уровня до оптимального.

Глицерин. Обладает криопротекторными свойства­ми: легко проникая внутрь спермия, он понижает температуру замерзания и препятствует обра­зованию кристаллов связанной воды, что позво­ляет избежать повреждений клеточных струк­тур. Благодаря высокой гидрофильности, пре­пятствует дегидратации цитоплазмы. Как раство­ритель электролитов и вещество не обладающее собственным осмотическим давлением, предуп­реждает опасное для клетки возрастание осмоти­ческого давления в процессе замораживания. Помимо глицерина, для защиты спермиев от криогенных повреждений могут использоваться полиэтиленоксид, диметилсульфоксид, поливи-нилпирролидон.

Желток куриных яиц. Содержит лецитин и липопротеины. Они создают на поверхности спермия адсорбционный слой, предохраняющий спермин от холодового шока. Помимо защитного действия, желток вносит в среду питательные и биологически активные ве-щества (аминокислоты, холестерин, жиро- и во-.| дорастворимые витамины и др.).

Спермосан ППК. Комплексный антибактериаль­ный препарат, состоящий из пенициллина, поли-миксина, канамицина. Такая комбинация эф­фективно тормозит размножение микроорганиз­мов в сперме.

В практике искусственного осеменения исполь­зуются и другие санирующие препараты: комбиспер-мосан, состоящий из левомицетина, ампициллина и полимиксина, ГАМП (гентамицин+ампициллин).

В состав некоторых разбавителей входят антиок-сиданты (токоферол, пигмент морских ежей), загусти­тели (гуммиарабик), свободные аминокислоты (глико-кол, аргинин) и другие компоненты.

Методика приготовления синтетических сред, техника, разбавления спермы

Для приготовления сред и разбавления спермы отводится специально оборудованное лабораторное по­мещение со средствами стерилизации воздуха и пред­метов (бактерицидные лампы).

Для приготовления сред используют дистиллиро­ванную (лучше бидистиллированную) воду, имеющую рН 6,8—7,0. Сухие компоненты пригодны только хи­мически чистые и проверенные на безвредность для спермиев. Их хранят в герметически закрытых стек­лянных банках в темном месте. Яйца используют только свежие (со сроком хранения не более 7 суток), полученные от здоровых кур при выгульном их содер­жании.

Среду готовят непосредственно перед употребле­нием в такой последовательности. В плоскодонную колбу отмеривают. нужный объем воды и, закрыв гор­ловину колпаком из полупергаментной бумаги или полиэтиленовой пленки, ставят на огонь. Воду доводят до кипения и кипятят 1—2 мин. Сняв с огня, охлаж­дают до 35. °С, после чего вносят в определенной пос­ледовательности сухие компоненты. После их раство­рения вносят желток куриных яиц. Яйцо моют, насу­хо вытирают, его поверхность стерилизуют спиртовым тампоном; затем раскалывают скорлупу по экватору на две половины и, осторожно перекладывая желток из одной половины в другую, удаляют белок в под­ставленную чашку. Желток переносят на стерильный бумажный фильтр. Проколов скальпелем желточную оболочку, дают вытечь желтку в колбу. Остатки жел­тка выдавливают через сложенные концы фильтро­вальной бумаги, пока на ней останется лишь одна пленка. При дозировании желтка исходят из того, что он имеет объем около 10 мл.

Содержимое колбы взбалтывают для равномерно­го распределения желтка, после чего в среду добавля­ют санирующий препарат.

Приготовление каждого разбавителя имеет свою специфику, которая отражена в прилагаемом к упа­ковке листке-вкладыше.

Свежеполученную сперму переливают в колбу или дозатор, подогретые до 35 °С.

Перед разбавлением сперма и среда должны иметь одинаковую температуру, для чего их помеща­ют в термостат, установленный на 35°С.

Сперму обычно разбавляют в два этапа. Вначале к сперме (но не наоборот) приливают небольшими пор­циями такой же объем среды; после 5-10-минутной выдержки производят окончательное разбавление.

Разбавитель приливают к сперме небольшими порциями, чтобы избежать резкого изменения ее хи­мического состава.

Кратность разбавления определяют, основываясь на результатах оценки эякулята по концентрации и подвижности спермиев, а также объема спермодозы. Сперму быка и хряка разбавляют в 2-6 раз, барана и жеребца — в 2-4 раза.