Билет 38

1) Структура бактериальной клетки. Строение цитоплазматической мембраны и мезосом, их роль.

Бактериальная клетка состоит из клеточной стенки, цитоплазматической мембраны, цитоплазмы с включениями и ядерного аппарата, называемого нуклеоидом. Имеются другие структуры: мезосома, хроматофоры, тилакоиды, вакуоли, включения полисахаридов, жировые капельки, капсула (микрокапсула, слизь), жгутики, пили. Некоторые бактерии способны образовывать споры.

ЦПМ - основной барьер, отграничивает протопласт микроорганизмов от окружающей среды. Состоит из бислоя фосфолипидов, в который включены интегральные и неинтегральные белки. Нет стеролов (кроме микоплазм).

Функции:

• избирательный активный транспорт;

• осмотический барьер;

• выделяет гидролитические ферменты;

• связана АТФаза (синтезирует АТФ);

• прикрепляются жгутики и ворсинки (пили и фимбрии) - функционируют с затратой энергии;

• содержание ферментного комплекса репликации ДНК нуклеоида;

• содержание ферментного аппарата, участвующего в синтезе собственых структур.

Мезосомы - инвагинации ЦПМ в цитоплазму с сохранением физической непрерывности мембраны. У Гр- имеют простую форму, у Гр+ имеют сложную форму (пластинчатые, везикулярные, трубчатые). Участвуют в компартментализации (разделяет на отсеки и разграничивает химические реакции) клетки и так же играют роль в репликации хромосомы и ее расхождению по дочерним клеткам.

2) Применение культур клеток в диагностике вирусной инфекции. Цитопатическое действие вирусов (цпд), формы проявления.

Методы диагностики вирусной инфекции направлены на индикацию и идентификацию возбудителя.

Индикация: по цитопатическому действию вируса (возникновение видимых дегенеративных изменений), по способности к гемадсорбции, по образованию бляшек, по цветной пробе. Идентификация по реакциям нейтрализации.

Идентификация по ЦПД. Вирусосодержащим материалом, подлежащим идентификации, обычно служит культуральная жидкость из пробирок с культурой, давшей ЦПД при заражении материалом. Для постановки опыта культуральную жидкость смешивают с равным объемом диагностической иммунной сыворотки (разведение 1:5 или 1:10). После 1-2 часов контакта при комнатной температуре с этой смесью заражают 4 пробирки с культурой клеток, из которой предварительно была удалена питательная среда; после добавления смеси в пробирки вносят по 0.8 мл свежей среды. Обычно пробы проверяют с несколькими типовыми сыворотками. Контроли: контроль незараженной культуры, контроль дозы вируса, контроль культуры, зараженной смесью культуральной жидкости с нормальной сывороткой.

Опыт учитывают через 5-7 дней, просматривая пробирки под малым увеличением микроскопа. В первом контроле ЦПД должно отсутствовать, во втором и третьем - обязательное проявление ЦПД. Отсутствие цитопатического эффекта в пробирке указывает на то, что вирус нейтрализован сывороткой -> сыворотка подходит под вирус.

Реакция задержки гемадсорбции. Гемадсорбцией называется способность культур клеток, зараженных вирусами, адсорбировать на поверхности эритроциты. Сходный механизм с реакцией гемагглютинации.

Техника. Зараженные клетки приобретают способность к гемадсорбции раньше, чем осуществляют ЦПД, поэтому пригоден для более ранней постановки диагноза. Культуру клеток заражают. Затем в пробирку вносят по 0.2 мл 1% эритроцитов и выдерживают пробирки в наклонном положении, чтобы эритроциты соприкасались с клеточным слоем. Ставят такую реакцию каждые два дня до появления адсорбции (8-10 день). Пробирки потом оставляют в вертикальном положении и дают осесть неадсорбированным эритроцитам. Положительная реакция - адсорбция эритроцитов на клеточном слое, видимая под микроскопом.

Для реакции нейтрализации надо добавить в пробирку вируснейтрализаующую сыворотку, в результате чего гемадсорбция замедлится или не произойдет -> профит.

Реакция торможения гемагглютинации (РТГА). Если предварительно соединить вирус с специфической иммунной вируснейтрализующей сывороткой, а потом добавить эритроциты, то гемагглютинация затормозится или не наступит -> наступила или нет нейтрализация при РГА.

Техника. На плексигласовой доске готовят двукратные возрастающие разведения от 1:10 до 1:320. Во все лунки, кроме контрольной, добавляют по 0.25 мл рабочей дозы вируса, доза была оттитрована в РГА. После выдерживания реакции в течение 1 часа при комнатной температуре добавляют по 0.5 мл 1% взвеси эритроцитов. Учет результатов через 30-40 минут. Где гемагглютинации нет или она минимальная - там сыворотка совпала с вирусом -> произошла агглютинация -> профит.

Реакция гемагглютинации (РГА). ОНА НЕ НЕЙТРАЛИЗАЦИИ, НО НУЖНА ДЛЯ ПОНИМАНИЯ! Гемагглютинация не иммунологическая, т.к. нет реакции антиген-антитело. С помощью нее легко выявить, но невозможно идентифицировать.

Техника. На плексигласовой доске готовят двукратные разведения в объеме 0.5 мл исследуемого вируссодержащего материала, начиная с 1:10 до 1:1280. В эти же луночки добавляют равные объеме 1% взвеси эритроцитов. Положительная реакция -> гемагглютинация (оседание эритроцитов в виде зонтика), отрицательная -> компактный диск на дне диска.

Метод бляшек. Это не метод нейтрализации, но с помощью него, но, если по этому методу заражать культуру клеток, которая нейтрализована нужной сывороткой, то бляшки не образуются или количество их значительно снижено.

Бляшками называются округлые участки разрушенных под действием вируса клеток однослойной культуры. Для получения бляшек клеточный монослой заражают небольшой концентрацией вируса и фиксируют адсорбировавшиеся на клетках вирионы с помощью агарового покрытия, в которое добавлен витальный краситель - красный. В таких условиях ЦПД вируса имеет очаговый характер, погибшие клетки дегенерируют, теряют способность удерживать красный цвет и обесцвечиваются. В результате на непрозрачном равномерно розовом фоне клеточного монослоя появляются бляшки в виде более прозрачных неокрашенных круглых пятен.

Нейтрализация методом цветной пробы. Цветная проба основана на разнице в цвете среды с индикаторами фенолрот, в которой растет нормальная, жизнепособная культура клеток, и среды, где находится культура, зараженная вирусом. В процессе развития нормальной культуры клеток происходит постепенное накопление кислых продуктов метаболизма -> сдвиг pH в кислую сторону. Среда с изначально красным цветом вследствие снижения pH принимает желтый цвет. Желтый - отрицательное, красный - положительное (при вирусах тормозятся процессы метаболизма клетки, pH не снижается). Если перед реакцией смешать культуру вируса с вируснейтрализующей сывороткой, а потом уже проводить реакцию, то желтый цвет будет означать нейтрализацию вируса -> профит.

Техника. Делают по 0.25 мл возрастающих двукратных разведений. Обычно изменение цвета питательной среды на 5-6 день выдерживания в термостате.

Под цитопатическим действием (ЦПД) понимают совокупность морфологических и функциональных (в т.ч. биохимических) изменений в клетках, возникающих под влиянием внедрившегося вируса. Предполагается, что основная причина ЦПД - нарушение метаболизма клетки. Цитопатическое действие учитывают по четырехкрестовой системы: ++++ - полный лизис, +++ - единичные клетки, НЕ пораженные вирусом, ++ - изменения у 50% клеток, + - отдельные клетки, на краевых участках.

Формы проявления ЦПД:

• Лизис клеток.

• Симпластообразование - образование гигантских многоядерных клеток.

• Включения - образование внутриклеточных включений (места сборки вирусных частиц).

• Латентная вирусная инфекция - репродукция вируса при отсутствии выраженной ЦПД.

• Трансформация - клетки начинают делиться, и располагаются не монослоем, а растут беспорядочно в несколько слоев.

Индикация по ЦПД. Заражают однослойную культуру клеток, внося по 0.1 мл исследуемого материала и добавляют питательную среду до 1 мл. Каждую пробу в 4 пробирки. Контроль: несколько незараженных с той же средой. Выдерживают в термостате при 37С и микроскопируют.