Исследование физико-химических свойств белковых веществ. Диализ.

Диализом очищают высокомолекулярные растворы белковых веществ от примеси низкомолекулярных соединений (солей, сахаров и др.).

Реактивы: а) раствор яичного белка с хлористым натрием; б) азотнокислое серебро, 0,5%-ный раствор (в склянке темного стекла); в) азотная кислота, 10%-ный раствор; г) гидроксид натрия, 10%-ный раствор; д) сульфат меди, 1%-ный раствор. В мешочек из целлофана или коллодия (или в высушенный пузырь теленка, поросенка) наливают до половины раствор яичного белка (с хлористым натрием). Мешочек подвешивают на стеклянной палочке и погружают в стакан с дистиллированной водой (рис. 1). Диализ проводят при комнатной температуре. Через 40—60 мин. из стакана берут в две пробирки по 2 мл воды. В одной пробирке проводят реакцию на ионы хлора, для чего воду подкисляют несколькими каплями 10%-ного раствора азотной кислоты и добавляют 2—3 капли раствора азотнокислого серебра, выпадает белый осадок хлорида серебра. С пробой во второй пробирке производят биуретовую реакцию. Если диализ проводится правильно, биуретовая реакция будет отрицательной.

Диализ можно ускорить, периодически меняя воду в стакане (через каждые 15—20 мин.) или же используя проточный диализатор.

Диализ проводят до получения отрицательной реакции на ионы хлора.

Примечания: 1. Для приготовления мешочков рекомендуется разрезать целлофан на куски размером 12,5 Х 12,5 см.

2. Для приготовления мембраны из коллодия в чисто вымытую и высушенную круглодонную колбу емкостью 50 мл или большую пробирку наливают коллодий (4%-ный раствор нитроклетчатки в смеси эфира со спиртом) и почти сразу же выливают обратно в склянку.

Медленно вращая колбу или пробирку, равномерно распределяют остатки коллодия по ее стенкам. Сосуд оставляют на несколько минут до исчезновения запаха эфира, после чего 2—3 раза ополаскивают небольшими порциями дистиллированной воды (по 5—8 мл) для удаления следов спирта.

Во время ополаскивания пленка начинает отслаиваться от стенок сосуда, тогда ее осторожно отделяют пинцетом. Чтобы ускорить отделение, осторожно наливают воду между отслоившейся пленкой и стенкой сосуда.

Определение изоэлектрической точки белка.

В изоэлектрической точке растворы белков неустойчивы. Молекулы белка с одинаковым количеством положительных и отрицательных зарядов легко выпадают в осадок. Значение рН, соответствующее изоэлектрической точке, является характерным для каждого белка. Выпадение белка в осадок в изоэлектрической точке можно ускорить добавлением водоотнимающих веществ (спирта, ацетона, эфира) или танина. Одни из них (органические растворители) уменьшают степень гидратации белковых макромолекул, разрушают их водные оболочки, другие, как, например, танин, образуют нерастворимые в воде соединения с азотистыми гетероциклическими группировками.

Реактивы: а) желатин, 0,5%-ный раствор; б) уксусная кислота, 0,1 н раствор; в) ацетат натрия, 0,1 н раствор; г) этиловый спирт, 96% -ный; д) танин, 0,1%-ный раствор.

В пять пробирок наливают растворы уксусной кислоты и уксуснокислого натрия в количествах, указанных в табл. 1, после чего в каждую пробирку добавляют по 1 мл раствора желатина и хорошо перемешивают, затем прибавляют по 4 мл этилового спирта (или по 1 мл раствора танина) и снова перемешивают. Через 5—10 мин. просматривают все пробирки и оценивают степень мутности смеси в каждой из них. рН наиболее мутной смеси соответствует изоэлектрической точке желатина. Результаты опыта записывают в таблицу, которую составляют по образцу табл. 1.

Табл. 1. Определение изоэлектрической точки белка

пробирки	Состав буферной смеси, мл		рН смеси	0,5%-ный раствор желатина, мл	Этиловый спирт, мл	Степень мутности (по пяти балльной системе)
	0.1н CH3COOH	0,1н CH3COONa
1	1,8	0,2	3,8	1	4	1
2	1,4	0,6	4,4	1	4	3
3	1,0	1,0	4,7	1	4	5
4	0,6	1,4	5,1	1	4	4
5	0,2	1,8	5.7	1	4	3

Реакции осаждения белков.

При денатурации нарушается активная конформация белковой макромолекулы. Эти изменения касаются в первую очередь вторичной и третичной структуры без нарушения при этом ковалентных (пептидных) связей.

Факторы, вызывающие денатурацию, можно разделить на две группы: 1) к физическим относятся высокая температура, механические воздействия, обработка ультразвуком, действие ионизирующих излучений; 2) к химическим — осаждение ионами тяжелых металлов, минеральными и органическими кислотами, нейтральными солями аммония, щелочных и щелочноземельных металлов; органическими растворителями, алкалоидными реактивами. Аналогичное по результатам действие оказывают детергенты, мочевина, некоторые красители.

Механизм действия некоторых физических факторов следует рассматривать как комбинированный, например, воздействие ультразвуковых волн и ионизирующих излучений приводит также к химическим изменениям белковых макромолекул.

Реакции осаждения белков бывают обратимыми и необратимыми.

При обратимом осаждении макромолекулы белка в основном не подвергаются глубокой денатурации, а осадки могут быть снова растворены в первоначальном растворителе (например, воде). Обратимое осаждение вызывается действием нейтральных солей аммония, щелочных и щелочноземельных металлов (высаливание), спирта, ацетона, эфира и некоторых других органических растворителей.

При необратимом осаждении происходит глубокая денатурация белка, молекула теряет свойства гидрофильности и становится гидрофобным. Денатурированный белок неспособен к восстановлению своих первоначальных физико-химических и биологических свойств (нативных). Необратимое осаждение вызывается высокой температурой, действием концентрированных минеральных и некоторых органических кислот, ионов тяжелых металлов, алкалоидных реактивов, детергентов, красителей (что используется для стерилизации).