Лабораторная работа №5 Тема « Получение нуклеопротеидов и их анализ» (2 часа) Цели:

1. Формирование знаний о составе и структуре нуклеиновых кислот и их роли в функционировании организма.

2. Закрепление знаний о механизме передачи генетической информации, химических основах биосинтеза белка

3. Систематизация знаний о физико-химических методах анализа

4. готовностью использовать основные методы защиты от возможных последствий аварий, катастроф, стихийных бедствий (ОК-11) профиль подготовки: Физическая культура. Безопасность жизнедеятельности (очная форма обучения);

5. способностью использовать возможности образовательной среды для формирования универсальных видов учебной деятельности и обеспечения качества учебно-воспитательного процесса (ПК-5) профиль подготовки: Физическая культура. Безопасность жизнедеятельности (очная форма обучения).

Содержание

Проведение качественного анализа нуклеиновых кислот.

Обработка результатов анализа.

Формулирование выводов.

Работа с вопросами и расчетными задачами.

Требования к умениям бакалавров

Знать

1. Генетические механизмы биосинтеза белка

2. Пространственное и химическое строение нуклеиновых кислот

3. Качественные реакции на нуклеиновые кислоты

4. Термины

Уметь

Готовить образцы для анализа

Писать химические пространственные формулы ДНК,РНК.

Решать задачи по соответствующему разделу

Проводить качественный и количественный анализ

Методика опыта.

Получение нуклеопротеидов основано на их растворимости в щелочной среде и на осуждении слабыми кислотами. Нуклеопротеиды при кипячении с разбавленными кислотами гидролизуются; гидролизу частично подвергается также белковый компонент, а от нуклеиновой кислоты отщепляются пуриновые основания, пентоза и Н₃Р0₄. Отщепление же пиримидиновых оснований идет только при глубоком гидролизе.

Методика опыта. 10 г дрожжей помещают в небольшую фарфоровую ступку, добавляют 15 капель эфира, чтобы убить дрожжевые клетки, 10 мл воды и щепотку песка. Смесь тщательно растирают. К растертой массе приливают 50 мл 0,4%-ного раствора NaOH и снова растирают в течение 15 мин. Затем содержимое ступки переносят в центрифужные пробирки и центрифугируют (можно фильтровать). Центрифугат (фильтрат) переносят в стакан (лучше в высокий узкий цилиндр), куда добавляют из пипетки 5%-ный раствор СН₃СООН до полного

осаждения нуклеопротеида. Обычно для этого расходуется около 15 млСН₃СООН. Осадок отделяют центрифугированием. Для исследования осадок нуклеопротеидов подвергают гидролизу. Частичный гидролиз проводят кипячением препарата с 5%-ным раствором

H₂S0₄ в течение 1 ч. В начале гидролиза отщепляется белок небелкового компонента (нуклеиновой кислоты). Затем белок подвергают частичному расщеплению. Нуклеиновая кислота далее распадается на мононуклеотиды, а от них отщепляются пуриновые основания (аденин и гуанин), Н₃Р0₄ и частично пентоза. Продукты гидролиза обнаруживают при помощи специальных реакций. Выделение дезоксирибонуклеопротеида и определение дезоксирибонуклеиновой кислоты. Дезоксирибонуклеопротеид с дифениламином при нагревании дает синее окрашивание в результате гидролиза и освобождения дезоксирибозы, которая и реагирует с дифениламином. Рибоза с дифениламином образует продукты реакции, окрашенные в зеленый цвет.

Приготовление дифениламинового реактива — 1 г дифениламина растворяют в ледяной СН₃СООН с последующим добавлением 2,75 мл концентрированной H₂S0₄ ( d = l , 8 4 г/см³).

Методика опыта. 1 г печени растирают в течение 10—15 мин в фарфоровой ступке со 100 г промытого песка или с битым стеклом, постепенно подливая небольшими порциями 15 мл 5%-ного раствора NaCl. Затем растертую массу центрифугируют в течение 10—15 мин. Центрифугат переносят в стакан емкостью 100—150 мл и медленно, при помешивании стеклянной палочкой, добавляют 80—90 мл дистиллированной воды. Нерастворимый в воде дезоксирибонуклеопротеид выпадает в осадок и при помешивании стеклянной палочкой наматывается на нее в виде нитей. Палочку вместе с нитями осторожно вынимают и переносят в чистую пробирку, в которой дезоксирибонуклеопротеид растворяют в 1—2 мл 0,4%-ного раствора NaOH. К 5—10 каплям раствора дезоксирибонуклеопротеида добавляют равный объем дифениламинового реактива, перемешивают и помещают в кипящую водяную баню на 5—10 мин. Смесь постепенно становится синей.

Количественное определение нуклеиновых кислот.

Принцип метода

Метод основан на выделении рибонуклеиновых РНК) и дезоксирибонуклеиновых (ДНК) кислот и на дальнейшем их анализе прямыми и косвенными методами. К прямым методам относятся такие, которые включают гидролиз нуклеиновых кислот с последующим выделением из гидролизатов пуринов и пиримидинов и определение их хроматографический методом. Хроматография позволяет производить точный микроанализ нуклеиновых кислот. Исследование пуринов и пиримидинов проводят в ультрафиолетовом свете, наблюдая флуоресценцию пятен на хроматограммах или в экстрактах, полученных из соответствующих участков хроматограмм. Кроме хроматографического метода, применяют также способ электрофореза на бумаге.

К непрямым (косвенным) методам относятся такие, в которых нуклеиновые кислоты определяют по количеству освобождаемого Н₃Р0₄ в процессе их гидролиза и по количеству пентоз или по содержанию азота в нуклеиновых кислотах, определяемому методом Кьельдаля.