Лабораторная работа №9 Тема «Обмен белков. Особенности обмена белков и других азотсодержащих органических веществ» Основы метода распределительной хромотографии на бумаге (4 часа)

Цели:

1. Систематизация знаний о физико-химических методах анализа

2. готовностью использовать основные методы защиты от возможных последствий аварий, катастроф, стихийных бедствий (ОК-11) профиль подготовки: Физическая культура. Безопасность жизнедеятельности (очная форма обучения);

3. способностью использовать возможности образовательной среды для формирования универсальных видов учебной деятельности и обеспечения качества учебно-воспитательного процесса (ПК-5) профиль подготовки: Физическая культура. Безопасность жизнедеятельности (очная форма обучения).

Содержание

Проведение качественного анализа аминокислот

Обработка результатов анализа

Формулирование выводов

Работа с вопросами и расчетными задачами

Требования к умениям бакалавров

Знать

Особенности аминокислот и белков как буферных соединений

Термины

Уметь

Готовить образцы для анализа

Решать задачи по соответствующему разделу

Проводить качественный анализ

Основы метода распределительной хромотографии на бумаге

Это один из наиболее быстрых, точных и простых приемов анализа сложных смесей веществ. Сущность метода состоит в том, что при движении через пористую среду смесь веществ разделяется под действием различных факторов 1) различная адсорбируемость компонентов смеси; 2) обмен между ионами раствора и ионами на поверхности адсорбента; 3) различная растворимость образующихся труднорастворимых осадков; 4) различное распределение компонентов между двумя несмешивающимися жидкими фазами и т. д. В соответствии с этим хроматографию обычно подразделяют на адсорбционную, ионообменную, осадочную, распределительную и др. Преимуществами хроматографического метода по сравнению с другими методами анализа являются:

а) относительная простота оборудования и проведения определений, особенно качественных;

б) хроматографией на бумаге можно определять почти все типы химических соединений, органические и неорганические, независимо от их растворимости в воде;

в) при хроматографических определениях достаточно иметь очень небольшое количество вещества (обычно сотые и десятые доли миллиграмма);

г) хроматографией на бумаге можно разделять чрезвычайно близкие по строению соединения (гомологи или структурные изомеры);

д) быстрота проведения анализов. При разделениях сложных смесей веществ хроматографией на бумаге обычно затрачивают несколько дней, но при этом определяют до 20—30 соединений в многократной повторности.

Принцип метода распределительной хроматографии на бумаге основан на различии значений коэффициентов распределения веществ между двумя несмешивающимися жидкими фазами. Одной жидкой неподвижной фазой обычно является вода, которая содержится на бумаге в количестве 20—22% ее веса, а другой жидкой подвижной фазой — насыщенный водой органический растворитель, не смешивающийся или частично смешивающийся с водой чаще всего используются насыщенные водой н-бутиловый спирт, фенол, крезол и различные смеси органических реактивов.

Коэффициент распределения (а) данного вещества можно определить следующим образом:

Движение веществ при хроматографировании в процессе пропускания через бумагу оганического растворителя объясняется следующим образом. Волокна целлюлозы имеют сильное сродство к воде, находящейся в небольшом количестве в насыщенном водой органическом растворителе. Бумагу, содержащую 20% воды, можно представить себе как носитель стационарной, неподвижной водной фазы. Когда растворитель протекает через участок бумаги, на который были нанесены разделяемые вещества, то происходит распределение этих веществ между подвижной органической и стационарной водной фазами. При этом некоторая часть веществ выходит из бумаги и переходит в органическую фазу. Когда растворитель достигает участка бумаги, не содержащего разделяемых веществ, снова происходит перераспределение веществ между водной и органической фазами. На этот раз раделяемые вещества переходят из органической фазы в водную. При непрерывном прохождении растворителя через бумагу в результате такого перераспределения между двумя фазами происходит перенос разделяемых веществ от точки их нанесения на бумагу к точке, находящейся на некотором расстоянии в направлении течения растворителя. А так как коэффициенты распределения веществ между двумя фазами различны, то разделяемые вещества под действием подвижной фазы продвинутся на разное расстояние.

Зная величину коэффициента распределения, можно рассчитать расстояние, на которое продвинется данное вещество под действием определенного растворителя.

В практической работе наибольшее значение имеет величина R_f данного соединения, коэффициента скорости движения, представляющего собой отношение расстояния, пройденного данным веществом, к расстоянии пройденному фронтом растворителя:

Величины R_f для всех веществ могут быть легко определены, так как пути, пройденные данным веществом и фронтом растворителя, доступны непосредственному измерению на хроматограмме. Различают одномерную и двумерную хроматографию. При одномерной хроматографии растворитель пропускают по бумаге только в одном направлении, а при двумерной после пропускания растворителя в одном направлении бумагу высушивают и вновь пропускают другой растворитель в направлении, перпендикулярном движению первого растворителя. Для получения хороших хроматограмм необходимо использовать бумагу высокого качества. Хроматографическая бумага отличается от обычной фильтровальной бумаги большей чистотой и более равномерной плотностью. Бумага должна пропускать растворитель с достаточно медленной скоростью, чтобы при движении растворителя достигнуть полного разделения веществ между подвижной и неподвижной фазами, и достаточно быстрой, чтобы не допустить интенсивного испарения растворителя из бумаги.

При хроматографировании обычно используют такие сорта бумаги, которые обеспечивают скорость движения растворителя 1—2 см в час. Толщина бумаги влияет на скорость движения растворителя и на количество веществ, которое может удерживаться бумагой. При использовании бумаги невысокого качества (недостаточно чистой или имеющей различную плотность) пятна разделяемых веществ образуются не округлые и компактные, а размытые, с «хвостами». При этом очень трудно или невозможно идентифицировать и количественно определить разделяемые вещества. При точных количественных определениях недостаточно чистую хроматографическую бумагу необходимо дополнительно очищать в лаборатории от следов зольных элементов. Для этого можно рекомендовать предварительное пропускание через бумагу 0,1%-ного раствора 8-оксихинолина в н-бутиловом спирте. 8-оксихинолин связывает следы металлов и вымывает их из бумаги. После пропускания 8-оксихинолина через бумагу в течение 1—2 дней листы бумаги высушивают и используют для определений.

При хроматографическом анализе используют герметически закрытые камеры, внутри которых создается атмосфера, насыщенная парами растворителя, что препятствует испарению растворителя с поверхности бумаги. В камере сделано стеклянное окно для наблюдения за движением фронта растворителя. Камеры обычно изготовляют из нержавеющей стали или дерева. Деревянные камеры снаружи тщательно покрывают масляной краской, а внутри пропитывают парафином. Размер камер 80 X 30 X 80 см.

В верхней части камеры укрепляют 2—3 ванночки, лотка или кювета, в которые наливают растворитель (рис. 6). Эти ванночки или кюветы для растворителя представляют собой трубки из нержавеющей стали или стекла диаметром 3—4 см, которые наверху имеют продольную щель шириной 1 —1,5 см. Длина трубок соответствует длине камер. При хроматографировании верхний край листа бумаги опускают в ванночку, перекидывают через стеклянную палочку, укрепляют его и в ванночку наливают растворитель. На дно камеры ставят чашку или какой-либо широкий сосуд с растворителем для создания атмосферы, насыщенной парами растворителя.

Растворители. Для удовлетворительного разделения веществ важное значение имеет правильный выбор растворителя. Теоретически можно предсказать правильный выбор растворителя для разделения смеси тех или иных веществ, исходя из значений коэффициентов распределения этих веществ.

Однако коэффициенты распределения большинства веществ обычно неизвестны, подвижность разделяемых веществ часто не согласуется со значениями их коэффициентов распределения, поэтому гораздо легче выбрать необходимый растворитель эмпирически.

В настоящее время изучено очень много различных растворителей, пригодных для разделения смесей аминокислот, сахаров, органических кислот и других веществ хроматографией на бумаге, составлены таблицы значе­ний R_f этих веществ в различных растворителях, и для разделения смеси тех или иных веществ очень легко подобрать соответствующий растворитель. Но необходимо помнить, что отдельные аминокислоты, например, можно определять при различии их значений R_f не менее чем на 0,05, а сахара — на 0,1—0,2.

Растворители должны быть абсолютно чистыми, бесцветными или слабоокрашенными. Перед использованием их очищают перегонкой. Лучшие результаты дают растворители, которые частично смешиваются с водой.

Техника хроматографирования. Для разделения на хроматограммах необходимо очень небольшое количество веществ — десятые или даже сотые доли миллиграмма. Лучшее разделение достигается при нанесении на бумагу очень малого объема разделяемых веществ, обычно 0,0020—0,0200 мл. Для нанесения растворов разделяемых веществ на бумагу используют градуированные микропипетки, а лист бумаги кладут на стекло. Диаметр пятна раствора на бумаге не должен превышать 0,5— 1,0 см, т. е. за один прием на бумагу можно нанести не свыше 0,0020—0,0025 мл раствора. При большом объеме раствора диаметр пятна увеличится и качество хроматограммы ухудшится. Если вследствие низкой концентрации изучаемых веществ в растворе необходимо использовать объемы растворов более 0,0025 мл, их наносят в несколько приемов. При этом бумагу помещают в специальный штатив и каждую порцию раствора высушивают в токе теплого воздуха, под феном.

Хорошее разделение веществ, особенно аминокислот, получается также в тех случаях, когда растворы наносят на бумагу не в виде округлых пятен, а в виде полосок длиной 3 см и шириной не более 4—5 мм.

При выполнении одномерных хроматограмм на листе или на полоске бумаги, отступя на 5—6 см от верхнего края, простым карандашом проводят линию и на ней че­рез каждые 3—4 см ставят точки или проводят полоски, указывающие места нанесения на бумагу разделяемых веществ. Выше точек ставят соответствующие обозначения. Затем бумагу кладут на стекло или в штатив и наносят необходимые объемы растворов. Бумагу надо брать только за края чистыми сухими руками (лучше работать в резиновых медицинских перчатках).

При выполнении двумерной хроматограммы на лист бумаги размером 62 x 55 см раствор наносят в левом углу, отступя на 6—7 см от обеих сторон листа.

После нанесения веществ бумагу закрепляют в ванночке камеры, в ванночку наливают растворитель и закрывают камеру. Если растворитель движется со скоростью 1,5—2 см в час, то при использовании полосы или листа бумаги длиной 50 см он дойдет до нижнего края листа через 25—33 часа. При анализе смеси соединений, в состав которой входят вещества с высокими значениями R_f, хроматограммы обычно вынимают из камер, когда фронт растворителя дойдет до нижнего края бумаги. Если же значения R_f разделяемых веществ не превышают 0,6—0,7, то для лучшего разделения смеси необходимо пропускать растворитель еще 10—12 часов.

При выполнении одномерных хроматограмм для лучшего разделения аминокислот и сахаров предложен метод многократного пропускания растворителя. В этом случае растворитель пропускают по бумаге не один, а 5—7 раз, причем перед каждым новым пропусканием его удаляют с хроматограммы высушиванием.

Разделять вещества необходимо всегда при строго определенной температуре (обычно 20—22±2°). Для этой цели в лабораториях обычно оборудуются термостатированные хроматографические комнаты. При колебаниях температуры во время хроматографирования качество хроматограмм ухудшается. При выполнении двумерных хроматограмм после пропускания растворителя в первом направлении растворитель удаляют из бумаги высушиванием, лист бумаги помещают в камеру и другой растворитель пропускают в направлении, перпендикулярном движению первого растворителя.

Подавляющее большинство растворителей удаляют из бумаги высушиванием в токе воздуха при комнатной температуре или при температуре 40—60°С. Для этого служат специальные сушильные шкафы большого размера, через которые непрерывно просасывается подогретый воздух. Если специальных шкафов нет, можно пользоваться обычным сушильным шкафом при включенной тяге. Время сушки при этом значительно увеличивается. Некоторые малолетучие растворители удаляют из бумаги вымыванием эфиром или ацетоном.

Положение веществ на хроматограммах определяют после их обработки какими-либо реактивами, дающими цветные реакции с изучаемыми соединениями. Для обнаружения аминокислот — растворы нингидрина или изатина. После обработки бумаги теми или иными реактивами на хроматограмме появляются окрашенные пятна соответствующих соединений.

Обрабатывать бумагу реактивами можно тщательным равномерным опрыскиванием хроматограммы из пульверизатора или быстрым погружением хроматограммы в соответствующий раствор на 3—5 секунд.

Для точной идентификации соединений на хроматограммах часто бывает недостаточно лишь знания значений R_f этих соединений, и поэтому часто используют так называемый метод «метчиков», или «свидетелей». Для этого наряду с неизвестными аминокислотами, сахарами, органическими кислотами и т. д. на хроматограммы наносят набор известных соединений. После хроматографирования и проявления хроматограммы визуально сопоставляют цвет и положение на хроматограмме пятен известных и неизвестных соединений. Известные соединения в данном случае играют роль «свидетелей», или «метчиков».

Количественный анализ. Простейшим полуколичественным методом является визуальное сравнение интенсивности окраски и площади пятна данного соединения с окраской и плотностью пятен «метчиков», которые наносили на ту же хроматограмму в известной концентрации. Однако точность такого метода не превышает 20—30%.

Модификацией этого метода является не визуальное сравнение интенсивности окраски пятен, а измерение плотности окраски пятен в проходящем свете специальными приборами— денситометрами. В этом случае точность метода повышается до 10—15%.

Наиболее точные методы количественного хроматографического анализа основаны на вымывании (элюировании) вещества из бумаги какими-либо растворителями и колориметрическом определении концентрации вещества в элюате. Точность этих методов для многих соединений составляет 3—6%. Для определения положения на хроматограмме пятна данного вещества, которое должно быть элюировано, используют флюоресценцию, метод «метчиков» или опрыскивание хроматограмм очень слабым реактивом, дающим окраску с данным веществом. После установления положения пятна данного вещества участок бумаги, соответствующий площади пятна, вырезают и кладут в пробирку, содержащую соответствующий растворитель, и экстрагируют вещество из бумаги. Затем, добавляя в пробирку соответствующий реактив, раствор окрашивают и по интенсивности окраски определяют концентрацию вещества.