Лекция 7 основные типы биотехнологических процессов – III

7.1. Производство аминокислот

Производство аминокислот относится к одной из наиболее передовых областей биотехнологии. Аминокислоты получают путем химического синтеза или экстракцией из белковых гидролизатов.

Незаменимые аминокислоты могут получаться микробиологическим путем более эффективно, чем путем химического синтеза, так как при биологическом синтезе используемые микроорганизмы образуют аминокислоты в биологически активной L-форме. Как продуценты лизина изучаются Brevibacterium lactofermentum и бактерии рода Corynebacterium, также предложены способы биотехнологического получения изолейцина, треонина при использовании E. coli. Большинство исследованных штаммов микроорганизмов независимо от их систематического положения преимущественно накапливают L-аланин и глутаминовую кислоту. Значительно меньше штаммов и в меньшем количестве выделяют аспарагиновую кислоту, лейцин, валин, изолейцин, лизин. За рубежом 60% мощностей по производству аминокислот занимают глутаминовая кислота, далее идут метионин, лизин и глицин. Глутаминовая кислота производится при участии в качестве продуцента штамма Corynebacterium.

Способы получения аминокислот:

1. Одноступенчатый – при этом мутантный полиауксотрофный штамм-продуцент аминокислоты культивируют на оптимальной для биосинтеза среде. Целевой продукт накапливается в культуральной жидкости, из которой его выделяют.

2. Двухступенчатый – при этом на первой ступени микроб-продуцент аминокислоты культивируют в жидкой питательной среде. Там происходит биосинтез предшественников аминокислоты (заготовка) и ферментов, которые катализируют образование целевого продукта. На второй ступени целевой продукт (аминокислота) синтезируется с помощью этих ферментов.

Микробиологическое производство l-глутаминовой кислоты

Это заменимая аминокислота, но на её основе синтезируются многие БАВ, которые необходимы для нормальной жизнедеятельности человека. Глутамат натрия применяется как добавка к пище для улучшения её вкусовых качеств. В медицине глутаминовая кислота используется при лечении заболеваний, связанных с отравлением печени и почек.

В наибольших количествах микробиологическим путем получают глутаминовую кислоту с помощью ауксотрофных мутантов рода Corynebaсterium и др. Известны методы получения глутамата на этанольных средах (до 60 г/л ) и на ацетате (до 98 г/л).

В основе сверхсинтеза глутаминовой кислоты из глюкозы у этих бактерий лежат два биохимических принципа: недостаток -кетоглутаратдегидрогеназы (включает предшественник глутаминовой кислоты в цикл трикарбоновых кислот); блокировка биосинтеза биотина – при этом нарушается нормальный синтез фосфолипидов мембраны и она становится более проницаемой для глутамата.

Технология получения l-глутаминовой кислоты

Одноступенчатый способ. Посевной материал получают в строго асептических условиях в течение суток.

Состав питательной среды для промышленных штаммов Corynebaсterium glutamicum при производстве посевного материала (в %): меласса – 8, кукурузный экстракт – 0,3 , хлорид аммония – 0,5, фосфат калия двухзамещенный – 0,05, сульфат магния – 0,03, вода – до 100%; pH среды 7,0-7,2.

Накопление биомассы производят в аэробных условиях сначала в инокуляторах объёмом 2 м³, потом в посевных аппаратах объёмом 5 м³ (до 6-8 г ACB/л).

На стадии биосинтеза в питательную среду вводят до 2% мочевины, до 1% мела и до 0,1% синтетического пеногасителя; содержание мелассы увеличивают до 20%.

Биосинтез осуществляют в строго асептических условиях в ферментаторах объёмом 50 м³ с коэффициентом заполнения аппарата 0,7 в течение 48-52 ч и интенсивной аэрации.

Температура культивирования на всех стадиях – 28-30°С. В конце процесса культуральная жидкость содержит до 45 г/л глутаминовой кислоты. Выход её по отношению к потребленным сахарам составляет 45-50%.

Для получения глутаминовой кислоты в качестве пищевой добавки или в виде лекарственных форм технологическую схему добавляют следующими этапами:

• Предварительная обработка культуральной жидкости – добавление негашеной извести или известкового молока, последующее осаждение ионов кальция фосфорной кислотой. Осадок способствует лучшему отделению клеток продуцента и других балластных примесей.

• Отделение осадка – центрифугирование, фильтрация под давлением.

• Осветление фильтрата – активированный уголь, ионнообменная сорбция на анионите).

• Концентрирование осветленного раствора – вакуум-выпаривание при 40-60 °С. При этом из исходного раствора отгоняется 50-80 % воды.

• Осаждение кристаллов глутаминовой кислоты в изоэлектрической точке (рН 3,2) – подкисление концентрата соляной кислотой и охлаждение раствора до 4-15 °С. Многократная перекристаллизация позволяет увеличить чистоту кристаллов до 99,6%.

• Отделение кристаллов глутаминовой кислоты от маточника – центрифугирование, декантанция и возврат маточника на стадию вакуум-выпаривания. Затем кристаллы промывают обессоленной водой.

• Сушка – в вакууме или в токе нагретого воздуха при 60-70 °С.

• Получение глутамата натрия – влажные кристаллы неперекристаллизованной глутаминовой кислоты обрабатывают гидроксидом натрия с последующими этапами согласно НТД. Глутамат натрия пищевой должен иметь следующий состав (в %): основное вещество – не менее 94, хлорид натрия – не более 5, влага – не более 1, общий азот – не менее 7,02.

Двухступенчатый способ. Для этого используют два варианта:

_{трансаминаза}

1 . -КГ + аминокислота L-глутаминовая кислота + - кетокислота

_{глутаматдегидрогениза}

2 . -КГ + NH₄⁺ + HAДH₂ L-глутаминовая кислота + Н₂О + НАД⁺

Продуценты – Pseudomonas, Escherichia, Kluyverd citrophila и Candida. Продуценты ферментов – различные микроорганизмы, например, E. coli. Доноры аминогрупп – аспарагиновая кислота или аланин.

Завершающие стадии процесса производства аминокислот – фасовка в полиэтиленовые мешки, упаковка и складирование готового продукта.

Технология получения L-лизина и кормовых препаратов на его основе – принципиально аналогичная. Лизин в организме человека и животных определяет биологическую ценность поступающего белка, способствует секреции пищеварительных ферментов и транспорту кальция в клетки, улучшает азотистый баланс.

лизин

Практически весь производимый лизин расходуется на обогащение кормов сельскохозяйственных животных и птицы: жидкий концентрат лизина, кормовой концентрат лизина, высококонцентрированные кормовые препараты лизина.

Технология производства L-аспарагиновой кислоты (сырье – фумаровая кислота и аммиак):

• выращивание клеток методом глубинной ферментации и их выделение центрифугированием;

• иммобилизация бактериальных клеток (биокатализаторов), которые обладают аспартазной активностью и катализируют присоединение аммиака по двойной связи фумаровой кислоты, в геле в виде гранул размером 2-3 мм. Время полуинактивации таких клеток составляет 4 мес.;

• биотрансформация фумарата аммония в колонке с катализатором в проточном режиме и получение L- аспарагиновой кислоты;

• кристаллизация, центрифугирование и промывка кристаллов.

7.2. Производство органических кислот

Органические кислоты используются в пищевой, химической, фармацевтической, лёгкой промышленности, в быту. Все органические кислоты являются промежуточными или конечными продуктами катаболизма углеводов.

С помощью микроорганизмов можно получить до 60 органических кислот. Многие из них получаются в промышленном масштабе – итаконовая, молочная, уксусная, лимонная, яблочная, янтарная. Эти пищевые кислоты используются как регуляторы кислотности и консерванты. Лимонную кислоту получают с помощью Yarrowia lipolytica, Aspergillus niger, молочную – Endomycopsis fibuligera, Rhisopus oryzae, Lactobacillus casei, янтарную – Anaerobiospirillum succiniproducens. Уксусную кислоту получают путем микробиологической конверсии водорода и углекислого газа бактериями Acetobacterium woodi и Clostridium aceticum.

Микробиологические процессы получения органических кислот делят на две группы: анаэробные – реализуют как глубинным, так и поверхностным методами ферментации (молочная, пропионовая); аэробные – реализуют глубинными методами ферментации (уксусная, лимонная, итаконовая, глюконовая).

Получение молочной кислоты

Молочная кислота (лактат) используется в качестве подкислителя при производстве джемов, желе, кондитерских изделий, наливок, экстрактов, при консервировании овощей, для регулирования рН пивного сусла, в кожевенной, текстильной, фармацевтической промышленности, при производстве растворителей, пластификаторов, лаков, олиф, моющих средств, при отделке натуральных тканей.

Продуценты молочной кислоты – молочнокислые бактерии 4 родов: Lactobacillus, Leuconostoc, Streptococcus, Pedicoccus. Род Lactobacillus включает три подрода: Thermobacterium – не растут при 15ºС, но выдерживают температуры выше 50ºС; Streptobacterium – не являются термофильными; Betabacterium – образуют D,L-молочную кислоту из глюкозы.

Различают: гомоферментативные молочнокислые бактерии – образуют из гексоз преимущественно молочную кислоту (термо- и стрептобактерии, стрептококки и педикокки); гетероферментативные молочнокислые бактерии – наряду с молочной кислотой образуют уксусную кислоту, диоксид углерода и этанол (бетабактерии и лейконостоки).

Субстрат для молочнокислых бактерий – мальтоза, лактоза, глюкоза, осахаренный крахмал и др. Среда должна также содержать витамины группы В, аминокислоты, пурины, пиримидины, органические кислоты и др.

В промышленном производстве, как правило, используют термофильные гомоферментативные виды (например, Lactobacillus delbrueckii штамм Л-3, у которого выход молочной кислоты составляет 95-98% от потребленной сахарозы).

Технологическая схема получения L(+)-молочной кислоты

Lactobacillus delbrueckii засевают на мелассную среду, которая содержит 5-20% сахара, вытяжку солодовых ростков, дрожжевой экстракт, витамины, фосфат аммония. Брожение протекает при 49-50ºС при рН 6,3-6,5. По мере образования молочной кислоты среду периодически нейтрализуют мелом. Процесс завершается за 5-10 дней; при этом в культуральной жидкости содержится 11-14 % лактата кальция и 0,1-1,5 % сахарозы.

Клетки бактерий и мел отделяют фильтрованием (отход), фильтрат упаривают до концентрации 30%, охлаждают до 25ºС, кристаллизуют (1,5-2 суток).

Кристаллы лактата кальция обрабатывают серной кислотой при 60-70ºС. При этом гипс выпадает в осадок. К надосадочной жидкости добавляют желтую кровяную соль при 65ºС для удаления ионов железа, а затем сульфат натрия для освобождения от тяжелых металлов. Красящие вещества удаляют с помощью активированного угля. Затем раствор молочной кислоты подвергают вакуум-упариванию до 50% или 80%. Такую молочную кислоту используют для технических целей. Более очищенную молочную кислоту получают при перегонке ее сложных метильных эфиров, при экстракции простым изопропиловым эфиром в противоточных насадочных колоннах.

Известна технология получения молочной кислоты с помощью клеток Streptococcus thermophilus, которые адгезированы на микросферах из активированного угля и помещены в биореактор, который работает по принципу ''кипящего'' или псевдоожиженного слоя, через который перемещаются микросферы. В нижней части они сорбирует субстрат, а в верхней части – молочную кислоту. Среда содержит глюкозу, дрожжевой экстракт, ацетат натрия, двузамещенный цитрат аммония, двузамещенный фосфат калия, сульфаты магния и марганца. Продуктивность системы – 12 г/(лч) молочной кислоты.