9.3. Физическая иммобилизация ферментов

При этом фермент включают в какую-либо изолированную фазу, которая отделена от фазы свободного раствора, но способна обмениваться с находящимися в последней молекулами субстрата.

Методы физической иммобилизации

1. Иммобилизация путем адсорбции на нерастворимых носителях – основана на удержании фермента на носителе за счет ван-дер-ваальсовых и гидрофобных взаимодействий, электростатических сил и водородных связей между носителем и поверхностными группами белка. После отмывки неадсорбировавшегося фермента препарат можно использовать. Метод применяется для иммобилизации каталазы, пепсина, аспарагиназы и др.

На адсорбцию фермента влияют следующие факторы: удельная поверхность и пористость носителя; рН, ионная сила и концентрация раствора фермента; температура.

Приемы:

1. Статический – носитель и водный раствор фермента смешивают и оставляют на сутки или более. Иммобилизация достигается за счет самопроизвольной диффузии фермента к носителю с последующей его адсорбцией.

2. Перемешивание раствора фермента и носителя с помощью магнитной мешалки.

3. Электроосаждение – в раствор фермента погружают два электрода, на один из которых нанесен носитель, и пропускают электрический ток.

4. Метод нанесения в колонке – через колонку с носителем прокачивают раствор фермента.

Для повышения эффективности адсорбции носитель и фермент предварительно модифицируют. Так, носитель выдерживают в буферном растворе или обрабатывают, например, веществами, молекулы которых содержат большое число функциональных групп (альбумин). Ферменты обрабатывают соединениями, содержащими ионогенные группы (поликислоты, карбоксиметилцеллюлоза и др.). Для дополнительного удержания фермента на носителе используют электроудержание.

Преимущества метода – доступность и дешевизна сорбентов, простота методики. Недостатки метода – фермент удерживается на носителе недостаточно прочно.

2. Иммобилизация путем включения в поры геля – молекулы фермента включают в трехмерную сетку из тесно переплетенных цепей, образующих гель. На активность ферментов влияет содержание фермента, размеры гелевых частиц и природа полимерной матрицы.

Гели образуют из крахмала, агар-агара, каррагинана или агарозы. Сшитые гели можно получить, например, при воздействии на водные растворы поливинилового спирта гамма-излучением или потоком электронов. Используют включение ферментов в матрицу из фотополимеризующихся смол. Они содержат фоточувствительные функциональные группы и при действии ультрафиолетового облучения образуют между собой ковалентные связи и трехмерную сетку.

Для получения неорганических гелей используют поликремниевую кислоту (силикагель) или фосфат кальция.

Метод применяется для иммобилизации лактатдегидрогеназы, пероксидазы, α- и β-амилаз, трипсина и др.

Способы:

1. Фермент вводят в водный раствор мономера, а затем проводят полимеризацию. В реакционную смесь добавляют сшивающие агенты, которые придают полимеру структуру трехмерной сетки. Таким путем иммобилизуют трипсин, рибонуклеазу и - амилазу.

2. Фермент помещают в раствор уже готового полимера, который затем переводят в гелеобразное состояние.

Преимущества метода: простота методики; возможность создания иммобилизованных препаратов любой геометрической конфигурации (сферические частицы, пленки); высокая химическая, механическая и тепловая стойкость; неоднократность использования; универсальность – метод применим для иммобилизации практически любых ферментов, а также полиферментных систем, клеточных фрагментов и целых клеток; ферменты защищены от бактериального загрязнения.

Недостатки метода: полимерная матрица создает препятствия для диффузии субстрата к ферменту. Это снижает его каталитическую активность; если субстратом является ВМС, то метод не применим.