18.2. Экспрессия генов

Экспрессия генов – проявление функциональная активность генов во время транскрипции и трансляции. Так были получены и внедрены в производство штаммы бактерий и дрожжей, которые способны продуцировать инсулин, соматотропин, интерферон, интерлейкины и другие биологически активные вещества. Созданы растения с повышенной кормовой и питательной ценностью, более значительным фотосинтезом и азотфиксацией, устойчивые к различным фитопатогенам. Большую перспективу открывает технология трансгенных животных. Создано стадо овец с геном человека, который контролирует выработку факторов свертываемости крови, используемых для лечения людей. Сконструированы бактерии, которые очищают каменный уголь от серы и превращают его в жидкое и газообразное топливо.

Технологическая схема клонирования и экспрессии генов следующая:

1. сортинг хромосом и получение ДНК;

2. введение ДНК в вектор;

3. трансформация, трансфекция, трансдукция и др.;

4. обнаружение и накопление клона клеток;

5. выделение рДНК (плазмиды);

6. определение нуклеотидной последовательности в клонированном фрагменте ДНК;

7. конструирование и построение плазмиды для экспрессии ее функций;

8. обнаружение и накопление клона;

9. выделение плазмиды и проверка нуклеотидной последовательности в рДНК;

10. трансформация;

11. выращивание культуры для получения экспрессируемого белка;

12. выделение белка.

18.3. Геномная библиотека

Геномная библиотека (банк генов) – это клонированный в составе векторов полный набор последовательностей ДНК данного организма. Такая фрагментация генома облегчает все генно-инженерные манипуляции, позволяет анализировать отдельные последовательности, выделять и работать с индивидуальными генами. Фрагменты геномной ДНК получают при помощи рестриктаз. Фрагменты ДНК связывают с плечами фага и упаковывают в головки фаговых частиц. Получается геномная библиотека, которая может храниться десятки лет под хлороформом, при температур – 70 ºС Поиск нужного гена проводят, заражая фаговой библиотекой бактериальные клетки и, высевая их на чашки Петра с агаризованной средой.

Кроме геномных библиотек создают библиотеки кДНК, которые представляют не все последовательности генома и не все гены, а только ту их часть, которая экспрессируется в данном организме. Можно получить библиотеки кДНК отдельных органов и тканей, характерных для различных стадий онтогенеза.

При скрининге кДНК, геномных библиотек и для анализа геномной ДНК используют метод блот-гибридизации. С помощью этого метода определяют чужеродный ген в геноме трансгенных растений, копийность гена, изменения в нуклеотидной последовательности гена и т.д.

Метод блот-гибридизации включает следующие этапы: рестрикция ДНК; перенос рестрикцированных фрагментов из геля на нейлоновый фильтр и их иммобилизация; гибридизация с меченым зондом.

Для выполнения этого метода фрагменты разрезанной рестриктазами ДНК разделяет электрофоретически в агарозном геле. Затем гель денатурируют 0,4 М раствором NaOH и покрывают его листом нейлонового фильтра. Фильтр покрывают слоями фильтровальной бумаги. Под действием капиллярных сил ДНК-фрагменты перпендикулярно переносятся на фильтр и связываются с ним, т.е. иммобилизуются. Такой перенос называется блоттинг (от англ. blot – промокать). При этом на фильтре получается реплика с геля. Фильтр помещают в раствор с радиоактивно меченым одноцепочным зондом и гибридизуют с находящимися на фильтре фрагментами ДНК. Зонд гибридизуется только с теми фрагментами, которые содержат комплементарную ему последовательность ДНК. Затем фрагменты, с которыми связался меченый зонд, выявляют радиоавтографией. По радиоавтографу судят о присутствии нужного фрагмента в геноме, изменениях нуклеотидной последовательности, о числе копий гена в геноме.