16.2. Принципы селекции микроорганизмов

Мутационная изменчивость. Это естественный фактор эволюции. В популяции клеток в каждом поколении по каждому гену обнаруживается 10⁵ - 10⁷ мутантных клеток. Благодаря спонтанным мутациям микроорганизмы легко приспосабливаются к новым условиям существования. Частота мутаций возрастает после действия мутагенных факторов. Индуцированные мутации позволяют получить биообъект с высокими полезными продуктивными свойствами.

Так, мутанты некоторых прототрофов становятся способными к синтезу необычных продуктов. Так, если Streptomyces grisius синтезирует хлортетрациклин, то мутант полученный на его основе – тетрациклин.

Мутационные изменения приводят к физиологическим и морфологическим изменениям клетки. Поэтому у мутанта становятся иными требования к питательной среде и к условиям культивирования. У суперпродуцентов положительные мутанты встречаются реже, т.к. их геном уже насыщен мутациями.

Отбор положительных мутантов. Для этого проверяют тысячи мутантных культур, используют скрининговые методы или естественный отбор. Например, хересные винные дрожжи (Saccharomyces oviformis), при переокислении спирта образуют продукты, которые придают вину хересный букет. Но такие дрожжи чувствительны к концентрациям спирта выше 15%. Так, при длительном повышении содержания спирта до 18% и пользуясь методом естественного отбора, удалось выделить штамм, который образует херес при повышенных концентрациях спирта.

Положительные мутанты можно выделять успешнее, если знать особенности их метаболизма. При этом можно увеличить частоту получения положительных мутантов путем использования химических или биохимических факторов: селективная детоксикация питательного субстрата; добавление в питательную среду ингибитора целевого продукта; увеличение проницаемости клеточной мембраны; усиление выведения продукта из клетки; использование ауксотрофных мутантов; применение катаболитной репрессии; перевод ферментов из категории индуцируемых в разряд конституционных и т.д.

Так, при селективной детоксикации питательного субстрата токсические вещества взаимодействуют с продуктом сверхсинтеза. В результате детоксицируется субстрат и сохраняется выживаемость мутанта. Так получают бета-лактамные антибиотики, которые комплексируются с ионами тяжелых металлов или с токсическими аналогами аминоксилот.

Гибридизация микроорганизмов. Ранее этот метод селекции применялся редко, так как для микроорганизмов не свойственно скрещивание (половое размножение). Например, при гибридизации грибов используют вегетативную гибридизацию, которая аналогична половому процессу размножения. При этом генетический материал двух вегетативных клеток грибов обменивается при клеточном слиянии (парасексуальный цикл). Этот процесс можно оптимизировать методами клеточной инженерии.

Другой вид гибридизации – слияние протопластов. Протопласты – это клетки, лишенные клеточной стенки. Ее можно удалить следующими способами: выращивание клеток в присутствии антибиотиков, которые препятствуют образованию клеточной стенки; действие ферментом лизоцимом или комплексом ферментов микробного генеза (“дрожжелитин”).

Слиянию протопластов способствуют некоторые стимуляторы (полиэтиленгликоль). В гибридах затем легко образуется нормальная клеточная стенка.

Гибридизация микроорганизмов позволяет:

• интегрировать в одной клетке нужные свойства двух и более штаммов или видов. Так, дрожжи штамма Saccharomyces serevisiaе были скрещены с пивными дрожжами вида Saccharomyces carllsbergensis. Полученный гибрид полностью гидролизовал раффинозу до моносахаридов. Это не было характерно для родительских видов дрожжей;

• отбирать рекомбинанты второго поколения, т.е. после рекомбинации хромосом. При этом появляются клетки с новыми свойствами. Так, пивные дрожжи, сбраживающие сахарозу и мальтозу скрестили с дикими штаммами дрожжей, которые не сбраживали оба дисахарида. Получили гибрид, который не сбраживал сахарозу, но ассимилировал мальтозу. Такие клоны гибридов применяют при изготовлении “бархатного” пива (с несброженной сахарозой) и кваса;

• ввести в геном микроорганизма мутации других штаммов. Это сокращает длительность ступенчатого отбора. Так был получен штамм E. coli для производства треонина;

• инокулировать в бактерию гены, которые не характерны для данного вида или увеличить число уже существующих генов. Это повышает продуктивность микроорганизма по данному гену. Например, в E. coli были введены гены, определяющие синтез амилазы, целлюлазы, сахаразы и т.д.