17.2. Получение фрагментов чужеродной днк и их очистка

Источники ДНК – геном животных и растительных клеток, плазмиды, вирусы, фаги и др.

Получить ген можно следующими способами:

• Расщепление геномной ДНК рестрикционными эндонуклеазами, или рестриктазами (от лат. restrictio – ограничение; группа ферментов, относящихся к классу гидролаз, катализирующих реакцию гидролиза нуклеиновых кислот). Эти ферменты разрезают ДНК в определенных местах (сайтах).

• Искусственный синтез генов. В основе его лежит способность триплета нуклеотидов кодировать синтез определенной аминокислоты. Зная последовательность аминокислот в каком-либо пептиде, можно сконструировать соответствующую последовательность нуклеотидов. Таким образом удается получить лишь небольшие гены, например, кодирующие биосинтез короткого полипептида – соматостатина.

• Использование мРНК. С этой целью из клетки эукариот выделяют мРНК и на ней, как на матрице, при помощи фермента обратной транскриптазы или ревертазы инициируют синтез комплементарной копийной ДНК (кДНК). После этого на кДНК синтезируют вторую полинуклеотидную цепь, создавая двуспиральную ДНК.

В любом случае сразу получить готовый ген практически не удается. Необходимо удалять или досинтезировать определенные участки, приспосабливая ДНК к синтезу нужного продукта.

Для получения рекомбинантных ДНК используют ряд ферментов:

ДНК-полимеразы. Катализируют синтез дочерней нити ДНК на уже существующий матрице ДНК. Чаще всего используют ДНК-полимеразу I, изолированную из Е. сoli.

ДНК-лигазы. Соединяют фрагменты ДНК путем восстановления фосфодиэфирных связей между соседними нуклеотидами. С помощью ДНК – лигазы, например, фага Т4, соединяются фрагменты ДНК с любыми концами: «липкими» или «тупыми».

Нуклеазы. Осуществляют гидролиз молекул нуклеиновых кислот. Экзонуклеазы сокращают ДНК с обоих концов, а эндонуклеазы расщепляют связи внутри молекулы ДНК.

РНК-зависимая-ДНК-полимераза (ревертаза). Катализирует синтез ДНК на мРНК. При этом возникает кДНК. Она служит матрицей для синтеза второй нити ДНК с использованием ДНК-полимеразы или ревертазы.

Терминальная трансфераза. Досинтезирует пуриновые или пиримидиновые нуклеотиды к одной из нитей двойной спирали ДНК.

Эндонуклеаза фага. Отщепляет однонитчатые концы с 3´-конца двойной спирали ДНК.

Рестрикционные эндонуклеазы, или рестриктазы. Гидролизуют ДНК строго по определенным специфическим последовательностям, которые называются сайтами рестрикции. В настоящее время выделено более тысячи микробных рестриктаз. В генетической инженерии используется около 200 рестриктаз. Сначала рестриктазы разделяли на три группы в зависимости от длины узнаваемой последовательности нуклеотидов: 1 группа – размер сайта рестрикции равен четырем парам нуклеотидов; 2 группа – пяти и 3 группа – шести нуклеотидным парам.

Полученные с помощью рестриктаз фрагменты ДНК разделяют методом электрофореза в агарозном геле и полиакриламидном геле (ПААГ). Фрагменты ДНК окрашивают, например, бромистым этидием. Для этого их вырезают из геля и экстрагируют фенолом. Затем их концентрируют изобутанолом, переосаждают этанолом и проводят анализ выделенных и очищенных фрагментов. С помощью фрагментов ДНК с известными молекулярными массами определяют молекулярную массу фрагмента. В результате получают рестрикционные карты, т.е. последовательности ДНК с нанесенными на них сайтами разрезания для различных рестриктаз.

Затем проводят определение нуклеотидной последовательности фрагментов – секвенирование. Известно два принципа секвенирования: химический и ферментативный сиквенс.

Химический сиквенс основан на избирательной химической деградации нуклеотидов. Для этого одноцепочную молекулу ДНК, один конец которой имеет метку (³²Р) разделяют на четыре части и каждую из них обрабатывают реагентом, разрушающим одно или два из четырех оснований. Так, 60% муравьиная кислота разрушает пуриновые основания (А+Г), диметилсульфат – гуанидиновые основания, чистый гидразин – пиримидиновые основания (Т+Ц), 1,5 М NaСl – цитозиновые основания. Если поврежденные молекулы обработать пиперидином, то в ДНК образуется разрыв в том месте, где находились разрушенные основания. С помощью электролиза и радиоавтографии (³²Р) определяют положение разрушенного основания, а затем и нуклеотидную последовательность в фрагментах ДНК.

Ферментативный сиквенс, или секвенирование путем терминации (остановки синтеза) цепи. Терминирующими агентами являются 2,3-дидезокситрифосфаты (ддАТФ, ддГТФ, ддТТФ, ддУТФ), которые не могут образовывать фосфодиэфирную связь со следующим дезоксирибонуклеотидом. В результате элонгация цепи прекращается там, где в ДНК включился дидезоксирибонуклеотид. Полученные фрагменты разделяют в ПААГ, проводят радиоавтографию и по распределению фрагментов в четырех пробах устанавливают нуклеотидную последовательность ДНК.

С помощью этих методов расшифрованы нуклеотидные последовательности нескольких тысяч генов про– и эукариот. Так, секвенированы геномы дрожжей, дрозофилы, человека и др. Полученные результаты заносятся в базы данных – банки генов.