3.1.2.5.2. Методы получения хитозана. Щелочной гидролиз

Цель - удаление белка и белковых веществ из подмора путем перевода белковой части в растворимое состояние с последующим ее отделением от подмора.Рис.б.Установка щелочного гидролиза хитина.

1 .штатив

2.ячейка

3.мешалка 4.термостат 5.контактный

термометр 6.термометр

Водное эмульгирование

Сырье - сухие целые пчелы размером по 11-12 мм в количестве ЗОг взвешивали на технических весах и помещали в ячейку, подключенную к термостату, добавляли 300мл дистиллированной воды. Водное эмульгирование проводили при постоянном перемешивании двухлопастной мешалкой при 40-50°С в течение 40 минут. На стадии водного эмульгирования 10-12% белковых веществ переходит в водный раствор. По окончании эмульгирования суспензию фильтровали через стеклянный пористый фильтр ПОР 160 в колбе Бунзена и получали эмульгат коричневого цвета, а твердую часть подвергали депротеинированию.

Подмор депротеинировали водными растворами гидроксида натрия концентрацией 1%, 3% и10%. Щелочной гидролиз осуществляли двумя методами:

1. Жесткий щелочной гидролиз

6 Л

Твердый остаток после водного эмульгирования помещали в ячейку и суспендировали в 10% растворе ИаОН с концентрацией субстрата 10%. Гидролиз осуществляли при постоянном перемешивании мешалкой при 45-

50 °С в течение 2-х часов. Далее суспензию подвергали фильтрованию через стеклянный пористый фильтр ПОР 160 и получали хитин и гидролизат темно-коричневого цвета. Хитин промывали дистиллированной водой до рН = 7 (определение по лакмусовой бумажке) и высушивали в сушильном шкафу при 110°С в течение 12 ч до влажности 8 -10%.

2. Мягкий щелочной гидролиз

Гидролиз в мягких условиях при концентрации ШОН 3% проводили в две стадии, т.к. при депротеинировании подмора в одну стадию отделение белковой части составляет 50 - 55%. Для исчерпывающего отделения белка необходимо провести повторное депротеинирование. Становится возможным выделение кормового белка из щелочных гидролизатов, полученных в мягких условиях.

1. стадия:

100г сырья, взвешенного на технических весах, помещали в колбу на 2000мл и добавляли 3% ИаОН в количестве 2000мл (концентрация субстрата 5 %). Гидролиз осуществляли при комнатной температуре при периодическом перемешивании мешалкой в течение 24 ч. По окончании гидролиза разделяли суспензию на капроновом фильтре с получением гидролизата и хитин-меланинового комплекса. Полученный осадок промывали дистиллированной водой до нейтрального значения рН промывных вод и высушивали в сушильном шкафу при 110 °С до влажности 8-10%.

2. стадия:

Щелочную доочистку хитина проводили 1%-ным раствором ЫаОН и 0,1%-ным раствором Ма₂8 0₃ с концентрацией субстрата 10%. Гидролиз проводили в ячейке при постоянном перемешивании мешалкой при 65 - 70°С в течение 40 мин. Далее проводили фильтрацию на капроновом фильтре, хитин промывали дистиллированной водой до рН = 7 и высушивали в сушильном шкафу при 110 °С до влажности 8-10%.

Ферментативный гидролиз

Ферментативный гидролиз проводили в две стадии, т.к. при ферментативном депротеинировании подмора в одну стадию отделение белковой части составляет 45 -50%. Для исчерпывающего отделения белка необходимо провести повторное щелочное депротеинирование. Становится возможным выделение кормового белка из ферментного гидролизата.

1. стадия:

Водное эмульгирование подмора провели с концентрацией субстрата 10%. По окончании эмульгирования при помощи 10%-ного раствора №ОН довели рН суспензии до 7,0 и добавили ферментный препарат - трипсин в количестве 0,05% к общему объему суспензии (0,15г). Гидролиз проводили при 40-45 °С (не выше 50 °С) при постоянном перемешивании мешалкой в течение 2 ч.

Осадок промывали дистиллированной водой до рН=7 и высушивали при 110°С до влажности 8-10% .

2. стадия:

Щелочную доочистку хитина проводили 1%-ным раствором КаОН и 0,1% -ным раствором Ма₂803 с концентрацией субстрата 10%. Гидролиз проводили в ячейке при постоянном перемешивании мешалкой при 65 -70 °С в течение 40мин. Хитин фильтровали на капроновом фильтре, промывали дистиллированной водой до рН = 7 и высушивали в сушильном шкафу при 110 °С до влажности 8-10%

.

деацетилирования колбу охлаждали до 40 °С и фильтровали реакционную массу через стеклянный пористый фильтр ПОР 160 и капроновый фильтр. Хитозан промывали дистиллированной водой до нейтральной реакции промывных вод и высушивали в сушильном шкафу при 50 °С.

Гидролиз хитозана

После процессов депротеинирования и деацетилирования, проведенных в условиях аналогичных технологии получения хитозана из ракообразных (криля), пчелиный хитозан остается высокомолекулярным полимером и не обладает водорастворимыми свойствами. Для придания водорастворимости хитозан гидролизуют комплексом хитинолитических ферментов с получением олигомеров.

Навеску хитозана 1,0 г, взвешенную на аналитических весах, помещали в стакан объемом 250 мл, добавляли 40мл 1М уксусной кислоты, 10мл 1% №N3 и 106 мл дистиллированной воды. Суспензию перемешивали на магнитной мешалке до полного растворения хитозана (18-20ч). рН раствора доводили до 5.2 при помощи 1н ИаОН. Стакан с раствором хитозана помещали в термостат.

При достижении температуры раствора 55°С добавляли 100мг фермента предварительно растворенного в 2мл дистиллированной воды. Гидролиз осуществляли при температуре раствора 50-55 °С в течение 1-2ч. Гидролиз останавливали титрованием 1н раствором ЫаОН до рН = 8-9 при этом гидролизованный хитозан выпадал в осадок. Осадок промывали дистиллированной водой до рН=7, отделяли центрифугированием и подвергали лиофильной сушке

3.1.2.6. Определение влажност

и

температуре 500 °С. После взвешивания остывшего в эксикаторе тигля с золой его повторно прокаливают в течение 1 ч, и взвешивают с абсолютной погрешностью не более 0,001г. Зола имеет белый или беловатый цвет и не должна содержать черных вкраплений.

О)

Результат эксперимента: Массовая доля золы, Хз

^(тг^т!)

т

где ш2- масса тигля с золой, г ш1 — масса пустого тигля, г ш - навеска исследуемого образца, г