Получение изолированных колоний

Для получения изолированных колоний необходимо использовать селективные среды, создающие режим наибольшего благоприятствования для данного микроорганизма или группы микроорганизмов.

На данном этапе исследования возможно не только получение колоний микроорганизмов, но и одномоментная их идентификация. Такие питательные среды называются хромогенными.

Фирма “Sanofi Pasteur”(Франция) предлагает, например, следующие хромогенные среды: среду - Rapid’E.coli, предназначенную для прямой идентификации и подсчета E.coli и колиформ в продуктах питания и объектах окружающей среды (колонии колиформных микроорганизмов окрашиваются в голубой цвет, а кишечная палочка в розовый, разной интенсивности); среду - Rapid L.mono, предназначенную для обнаружения листерий (L.monocytogenes - колонии голубого цвета, L.ivanivii – зеленые колонии, Listeria spp.- белые колонии); среду - URISELECT3, для изоляции и количественного определения микроорганизмов в мочевом тракте (E.coli, Proteus spp., Streptococcus gr.D); среду - CANDISELECT, для выделения и прямой идентификации грибов рода Candida (колонии C.albicans - голубые, колонии C.tropicalis, C.krusei и C.glabrata- белые).

Отдел новых технологий НИИЭМ имени Пастера предлагает селективные среды для выделения и одновременной идентификации микроорганизмов: среда «Клебсиелла 5-АСК», предназначена для одноэтапного выделения в течение 20-24 часов и одновременной идентификации бактерий рода Klebsiella (видов K.pneumoniae, K.oxytoca, K.mobilis); среда «ПРОТЕУС ППМ», предназначена для одноэтапного выделения в течение 18-24 часов и одновременной идентификации бактерий группы родов Proteus, Providencia, Morganella; среда «ПСЕВДОМОНАС АПС», предназначена для одноэтапного выделения в течение 18-24 часов и одновременной идентификации Pseudomonas aeruginosa при температуре 42⁰С и Pseudomonas putida при 37⁰С; среда «УРЕАПЛАЗМА-96(или 102)», предназначена для одноэтапного выделения и одновременной идентификации Ureaplasma urealiticum в течение 24-48 часов; среда «МИКОПЛАЗМА-96(или 102, 120)» -– предназначена для одноэтапного выделения Mycoplasma hominis в течение 18-24 часов и одновременной идентификации.

Биохимическая идентификация

Идентификация выделенного штамма микроорганизма является наиболее трудоёмким и материально затратным исследованием, так же зависящим от целого комплекса предварительных манипуляций: точности приготовление сред, растворов, реактивов, навесок необходимых ингредиентов, качества дистиллированной воды, строгого соблюдения рН и температуры при приготовлении необходимого набора реагентов для идентификации, а также при дальнейшем их хранении и использовании. Все это обусловливает необходимость стандартизации ингредиентов исследования, контроля их качества.

Одним из наиболее часто применяемых в мировой практике в настоящее время способов быстрой идентификации различных бактерий, позволяющих стандартно и качественно проводить данный вид исследования, является использование высушенных питательных сред с субстратами, помещенными в лунки пластмассовых пластин для микротитрования. В них, в ходе инкубации испытуемого штамма, протекают биохимические реакции, результаты которой регистрируются визуально по изменению цвета индикатора. В большинстве тест-систем идентификации микроорганизмов время инкубации, в зависимости от вида набора, составляет 4 - 48 часов.

Автоматизированный метод

В приказе Министерства здравоохранения РФ № 380 от 25 декабря 1997 года большое внимание уделяется развитию микробиологических лабораторий. В Примерном перечне приборов, оборудования и медицинского инструментария (приложение № 8 к приказу № 380, а также согласно приказу № 8 от 1995 года) значатся: «Автоматическая и полуавтоматическая системы для микробиологических исследований (идентификация видов бактерий и определения их чувствительности к антибиотикам) в комплексе с тест системами», «Полуавтоматический программируемый фотометр для считывания оптической плотности в 96-луночных планшетах».

Для автоматизированных микробиологических исследований ряд фирм предлагают различные комплексы на базе специализированного планшетного фотометра и пакета компьютерных программ.

Важным направлением применения автоматизированных систем микробиологи является диагностика микобактерий. Культуральная диагностика туберкулеза в настоящее время переживает принципиальные изменения, связанные с внедрением в практику систем культивирования микобактерий на жидких средах – это “BACTEC MGIT 960” (“Becton Dickinson”,США) u MB/BacT (“Organon TekniKa”, Голландия). В результате внедрения этих систем среднее время детекции роста микроорганизмов значительно короче (10,7 дня для “BACTEC MGIT 960” и 18,7 дня на MB/BacT, против 33,2 дня на стандартной плотной среде Левенштейна-Йенсена) [Литвинов В.И., Мороз А.М., 2000].

На рынке микробиологической аппаратуры, для автоматизации процесса идентификации микроорганизмов, в РФ предлагаются ATB-Expression, фирма “bioMerieux”, Франция: Sceptor, фирма “Dina Handel”, Германия, “Bioscreen/iEMS-reader, фирма “Labsystems”, Финляндия: Walk-Away-40(96), фирма “Dade AG” и Cobas Micro , фирма “Becton Dickinson”, США и др.

Пример: автоматизированный комплекс для проведения микробиологических исследований с наиболее приемлемой стоимостью, а также возможностью его использования и как иммуноферментного анализатора (ИФА).

АО «Аналитика» на базе аппаратного обеспечения фирмы «Лабсистемс» (Финляндия)- Bioscreen/iEMS-reader и пакета компьютерных программ отечественного производства (в отличие от других производителей) создало автоматизированное рабочее место врача-бактериолога и химиотерапевта.

Программное обеспечение «БАКТ» предназначено для автоматизации процесса считывания результатов реакции в планшетных тест-системах (96 ячеек), обработки первичных данных по идентификации и определению степени чувствительности микроорганизмов к антибиотикам и проведения кинетических измерений с построением кривых их роста. Комплекс сформирован на базе специализированного 8-ми канального планшетного фотометра со встроенным термостатом, система контроля которого позволяет с точностью 0,2⁰С поддерживать необходимый температурный режим инкубирования планшета; прибор имеет встроенный орбитальный шейкер, колесо с набором из восьми светофильтров – 340, 405, 414, 450, 540, 620, и 690 нм; оптическая система позволяет проводить измерения в диапазоне от 0 до 4 единиц ОП; управление работой прибора осуществляется при помощи внешнего компьютера и программ «БАКТ» и «ИФА».

«БАКТ» позволяет:

• Работать с широким спектром тест-систем для идентификации бактерий различных групп; могут быть использованы как отечественные (НПО «Аллерген», Ставрополь), так и импортные (АОЛ «Лахема», Чехия) тест-системы;

• Провести идентификацию более 330 видов микроорганизмов;

• более 80 видов и групп из семейства энтеробактерий и вибрионов;

• 40 видов неферментирующих грамотрицательных бактерий;

• более 80 видов оксидазо (-)микроорганизмов;

• более 50 видов оксидазо (+)микроорганизмов;

• 35 видов стафилококков и микрококков;

• 49 видов стрептококков, энтерококков и аэрококков;

• 12 видов нейссерий;

• 10 видов коринебактерий;

• более 90 видов анаэробов.

• Проводить исследования по определению степени чувствительности к антибиотикам выделенных штаммов микроорганизмов, с использованием отечественных микропланшетных тест-систем, разработанных в ГНЦ по антибиотикам МЗ РФ для определения минимальных ингибирующих концентраций (МИК-тест) и для полуколичественных исследований (ТПК-тест);

• В режиме кинетического измерения:

• проводить учет степени бактериурии, обсемененности различных биосубстратов;

• получать «кривые роста» микроорганизмов, свидетельствующие о кинетике их размножения как под действием различных факторов, так и интактных;

• моделировать септический и местный гнойно-воспалительные процессы с подбором индивидуальной антибактериальной терапии;

• определять степень подавления механизмов антиинфекционной резистентности;

• проводить оценку бактерицидности сыворотки крови больного для выявления интенсивности подавления противоинфекционных механизмов защиты;

• получать калибровочные зависимости и производить расчет основных фармакокинетических параметров;

• проводить фармакокинетические исследования по определению концентраций антибактериальных препаратов, витаминов, аминокислот и т.п. в биологических жидкостях;

• проводить скрининг препаратов (или их комбинаций) для выявления их антибактериальной чувствительности;

• изучать влияние различных комбинаций антибактериальных препаратов на чистую или смешанную культуру микроорганизмов

• Оценивать качество питательных сред по степени накопления микробной массы;

• Через 5-6 часов выявлять пробы с исходной обсеменённостью более 10⁵ КОЕ/см², а через 16-18 часов получить точное количество микробных те в см² мочи и других биосубстратах;

• Проводить статистический анализ деятельности микробиологической лаборатории;

• Проводить эпидемиологический анализ:

• Отслеживать динамику смены чувствительности отдельных микроорганизмов и их ассоциаций к применяемым антибактеральным препаратам при определенных нозоформах, в отделении, в больнице;

• Получать сведения о количестве выделенных возбудителей гнойно-септических заболеваний;

• Получать полную сводку статистических и эпидемиологических данных по стационару в целом и по отдельным его подразделениям за любой отчетный период времени;

• Определять ведущую микрофлору по отделениям, биоматериалам и локализациям (диагнозам);

• Определять наиболее эффективные антибиотики в отношении ведущей микрофлоры и по каждому интересующему возбудителю;

• Обеспечить наиболее эффективный подбор антибактериальных средств для каждого конкретного больного;

• Выявлять наличие госпитальных инфекций;

• Выявлять формирование и циркуляцию госпитальных штаммов микроорганизмов.

• Наличие компьютерной версии «Журнала микробиолога».

ПРИМЕНЕНИЕ автоматизированной системы микробиологических исследований позволяет сократить, не менее чем в два-три раза, расходы на лечение больных за счет:

• значительного повышения качества лечения,

• сокращения сроков госпитализации,

• обоснованного планирования закупок наиболее эффективных для конкретного региона антибактериальных препаратов.

Ручной метод

Коммерческие микрообъёмные тест-системы по устройству представлены двумя группами: содержащими субстрат реакции в питательной среде или шаблоне - носителе. Результаты биохимических тестов учитываются визуально, вид микроорганизма устанавливается с помощью таблицы идентификации, кодов (профилей) или компьютерных программ.

Среди тест-систем, основанных на принципе «субстрат в питательной среде» используются: API 20E “Bio Merieux” (Франция); Enterotest 1 u Enterotest 2, Enterotest 16, Enterotest 16, Entero-Screen и другие (АО “Lachema”, Чехия); мультимикротесты MMTE 1 u MMTE 2 (НПО «Аллерген», Ставрополь); ПБДЭ (НПО «Диагностические системы», Нижний Новгород); тест-система «РАПИД-ЭНТЕРО 200М» (НИИЭМ имени Пастера, Санкт-Петербург).

К системам типа «субстрат на шаблоне носителя» относятся коммерческие тест-системы Micro-ID, Minitek, в которых субстрат и индикатор находятся на бумажных дисках, которые вносят в лунки планшетов с суспензией бактерий. Имеются дополнительно идентификационные полоски Микро-Ла-Тест: ОКСИ тест – для выявления цитохромоксидазы, ОНП-тест на бета-галактозидазу, КОЛИ-тест – на -D-глюкуронидазу, ВП-тест – на ацетоин и другие.

В Российской Федерации широко используются наборы « микро-ла-тесты» (НПО «Аллерген», Ставрополь, АО «Лахема» Чехия) среди которых:

 ЭНТЕРОтест 24 (16) – позволяющий в течение 18- 24 часов идентифицировать кишечные бактерии семейства Enterobacteriaceae u Vibrionaceae;

 ЭНТЕРО-Скрин – быстрая идентификация наиболее часто встречающихся энтеробактерий за 4 часа;

 НЕФЕРМтест 24 – идентификация в течение 48 часов грамотрицательных неферментирующих, изолированных из клинического материала, продуктов питания, поверхностных вод и т.д.;

 СТАФИтест 16 – идентификация бактерий рода Staphylococcus, изолированных из клинического материала, пищевых продуктов и т.п.;

 СТРЕПТОтест 16 – идентификация стрептококков;

 АНАЭРОтест 23 – идентификация в течение 48 часов более чем 90 видов анаэробных бактерий, изолированных из клинического материала;

 КОЛИтест – высокоспецифичный тест для быстрой идентификации E.coli;

 НЕЙССЕРИЯтест – идентификация в течение 4-24 часов клинически значимых нейссерий;

 URE-Нртест – быстрая идентификация Helicobacter pylori в биоптатах.

В 2001 году на рынке микробиологических реагентов появилась тест-система «РАПИД-ЭНТЕРО 200-М» (НИИЭМ имени Пастера, ОНТ, Санкт-Петербург), предназначенная для быстрой (5 часов) биохимической идентификации наиболее часто встречающихся в медицинской практике видов энтеробактерий – возбудителей гнойно-септических и острых кишечных инфекций. Рассчитанная на исследование 200 культур бактерий. Тест-система обеспечивает постановку 18 тестов: экспрессное определение цитохромоксидазы, феномена «тяжа» грамотрицательных бактерий, ферментацию глюкозы (1 час); выявление уреазы, триптофандезаминазы, индола, лизиндекарбоксилазы, орнитиндекарбоксилазы, ацетоина, сероводорода, нитратредуктазы; ферментации лактозы, эскулина, маннитола, маннозы, мальтозы, арабинозы, адонитола. Исследованию подлежат чистые культуры, выросшие из отсевов колоний со сред выделения на секторах питательного агара (или питательного агара с желчью). Предварительно проводится их групповая идентификация и определяется возможная принадлежность к семейству энтеробактерий экспресс-тестами: на цитохромоксидазу, тестом «тяжа» на грамотрицательные бактерии, ферментацию глюкозы микрообъёмным методом (учет через 1 час). Дальнейшему исследованию подлежат грамотрицательные, оксидазонегативные, ферментирующие глюкозу бактерии. Специфичность идентификации энтеробактерий составляет 97,6%. Диагностическая значимость: идентификация 96% изолятов энтеробактерий. Она наиболее экономична, обеспечивает большой объем исследований, проста и надежна в использовании. Стоимость одного исследования существенно дешевле, чем всеми другими тест-системами. НПО НИИЭИ имени Пастера предлагает широкий спектр реактивов для ускоренной (1-6 часов) микрообъемной биохимической идентификации микроорганизмов: определение уреазы; триптофанандезаминазы; индола; лизиндекарбоксилазы; аргининдигидролазы; орнитиндекарбоксилазы; ацетоина; глюкозы; ферментации углеводов и спиртов (лактоза, маннит, сорбит, адонит); ферментации углеводов и спиртов (сахароза, манноза, арабиноза, глюкоза); сероводорода; нитратредуктазы; цитрата натрия; ацетата натрия