Самостоятельная работа студентов на практическом занятии

1. Опыт «Конъюгация 1»: передача хромосомного признака фер­ментации лактозы (Lac+) y E. сoli.

Донор: E. Coli Hfr C Lac+ Sm^s

Реципиент: E. Coli K 12 F^- Lac^- Sm^r

Рекомбинант: ? (назовите его и укажите генетическую ха­рактеристику по указанным маркерам).

Условные обозначения: – Sm - стрептомицин; S - чувстви­тельный; г - хромосомный признак резистентности к антибио­тику.

К 5 мл суточной бульонной культуры реципиента добавьте 0,5 мл суточной бульонной культуры донора (густота 5х10⁸ м.т./мл). Смесь поместите в термостат на 30-60 минут, после чего сделай­те высев 0,1 мл на селективную среду Эндо со стрептомицином.

Контроли:

1) посев донора и реципиента на среду Эндо;

2) посев донора и реципиента на среду Эндо со стрептомицином. Через 18-24 часа просмотреть посевы.

Контроли:

1) на среде Эндо донор дает окрашенные в крас­ный цвет колонии за счет расщепления лактозы среды Эндо (меняется рН, меняется цвет индикатора), реципиент дает бес­цветные колонии, так как не расщепляет лактозы;

2) на среде Эндо со стрептомицином донор не растет, так как погибает под действием антибиотика, а реципи­ент, устойчивый к действию антибиотика, растет и дает бесцвет­ные колонии.

В опыте из конъюгационной смеси на среде Эндо со стрептомицином вырастают колонии реципиента и рекомбинанта.

Как их отличить?

Подсчитайте число колоний рекомбинанта и рассчитайте частоту передачи признака ферментации лактозы по формуле:

где: К - частота передачи признака;

n - число колоний рекомбинанта;

d - число клеток донора в конъюгационной смеси.

Зарисуйте схему опыта. Учтите результаты.

2. Опыт «Конъюгация 2»: передача плазмидного признака рези-стентности к тетрациклину (r Тc).

Донор: E.сoli M 17 Lac+ Sm^s (R Тc).

Реципиент: S.flexneri^- Lac^- Sm^r Tc^s

Рекомбинант: ? (назовите его и укажите генетическую ха­рактеристику по указанным маркерам).

К 5 мл суточной бульонной культуры реципиента добавьте 0,5 мл суточной бульонной культуры донора (густота 5х10⁸ м.т./мл). Смесь поместите в термостат на 30-40 минут, после чего сделай­те высев 0,1 мл на селективную среду Эндо со стрептомицином и тетрациклином.

Контроли:

1) посев донора и реципиента на среду Эндо со стрептомицином;

2) посев донора и реципиента на среду Эндо с тетрациклином;

3) посев донора и реципиента на среду Эндо со стрептомицином и тетрациклином.

Произведите учет результатов через 18-24 часа. Зарисуйте результаты эксперимента. Чьи колонии выросли из конъюгационной смеси на среде Эндо+Тс+Sm? Рассчитайте частоту переда­чи признака тетрациклино- резистентности по выше приведенной формуле (см. задание к опыту № 1).

3. Опыт по трансдукции: передача триптофанового признака (tгр⁺) у сальмонелл трансдуцирующим фагом Р 22.

Донор; S. typhimurium trp⁺ (лизогенный штамм по фагу Р 22)

Реципиент: S. typhimurium trp^-

Трансдуцирующий фаг: Р 22

Рекомбинант: ? (назовите)

Пояснение: штамм донора является прототрофом по триптофану, т. е. сам синтезирует эту аминокислоту, имея в со­ставе генома гены tгр⁺, кодирующие этот синтез. Геном этих бак­терий также содержит профаг фага Р 22.

Его локус в хромосоме клетки рядом с tгр⁺-генами. При индуцировании лизогенных кле­ток (УФ) фаг выходит из интегрированного состояния, захваты­вая trp-гены. При инфицировании новых клеток вирион фага пе­редает эти гены, осуществляя специфическую трансдукцию. В ка­честве реципиента взят ауксотрофный по триптофану штамм, ко­торый не способен синтезировать этой аминокислоты и нуждает­ся в ее присутствии в питательной среде для своего роста.

При постановке опыта лизогенный штамм донора обраба­тывают УФ лучами, центрифугируют со скоростью 10³ об./мин в течение 30 минут. Надосадочную жидкость (содержащую инду­цированный трансдуцирующий фаг) используют в дальнейшей работе. Центрифугат не содержит клетки донора.

К 3 мл суточной бульонной культуры реципиента (густота 5х10⁸ м.т./мл) добавьте 1 мл полученного центрифугата. Смесь помещают в термостат на 30-60 минут, после чего делают высев 0,1 мл на минимальную среду, не содержащую триптофана.

Контроли:

1) посев донора на минимальную среду;

2) посев реципиента на минимальную среду;

3) посев реципиента на среду с триптофаном;

4) посев центрифугата на минимальную среду;

5) посев центрифугата на среду с триптофаном.

Все посевы помещают в термостат. Учет результатов через 18-24 часа. Зарисуйте результаты эксперимента. Чьи колонии выросли на минимальной среде из трансдуцирующей смеси в опыте? Почему? Рассчитайте частоту трансдукции триптофанового признака по известной Вам формуле.

4. Опыт по трансформации: передача капсульного признака (caps⁺).

Донор: изолированная ДНК штамма К. pneumoniae (caps⁺)

Реципиент: штамм Е. coli caps^-

Рекомбинант: ? (назовите и укажите генетическую характе­ристику по указанному признаку)

В опыте произведен посев штамма реципиента на среду Эндо с добавлением ДНК донора.

Контроли:

1) посев штамма донора на среду Эндо;

2) посев штамма реципиента на среду Эндо.

Посевы помещены в термостат на 24 часа. Учтите результа­ты. Обратите внимание, что колонии донорского штамма на Эн­до лактозопозитивны (красного цвета), слизистой консистенции, а колонии реципиента лактозопозитивны, обычной мягкой кон­систенции. Оцените характер роста на среде Эндо с добавлением ДНК донора. Найдите колонии рекомбинанта. Как они выгля­дят? Зарисуйте схему постановки опыта. Опишите колонии до­нора, реципиента и рекомбинанта. Промикроскопируйте гото­вые мазки из колоний донора, реципиента, рекомбинанта, окра­шенные по методу Бурри-Гинса на выявление капсулы. Зарисуй­те результаты.