Аппаратура для выращивания микроорганизмов, стерилизации и других микробиологических исследований

1. Термостат – аппарат для выращивания микроорганизмов, в котором поддерживается температура в пределах 28-43^оС. Термостаты выпускают водяными или суховоздушными.

2. Микроанаэростат – аппарат для выращивания микроорганизмов в бескислородных условиях.

3. Сушильный шкаф (печь Пастера). Предназначен для стерилизации или сушки лабораторной посуды и других материалов. Он состоит из наружного корпуса, средней и рабочей камеры, панели управления и подставки.

4. Автоклав – предназначен для стерилизации паром. В микробиологических лабораториях используются автоклавы разных моделей (горизонтальные, вертикальные, стационарные, переносные и др.).

5. Холодильники – широко используются в микробиологических лабораториях для хранения при температуре около 4^оС музейных культур микроорганизмов, питательных сред, вакцин, сывороток и других препаратов.

Для сохранения биопрепаратов при температуре менее 0^оС используются низкотемпературные холодильники, в которых поддерживается температура – 20^оС и ниже.

6. Центрифуги – приборы для осаждения микроорганизмов, эритроцитов и других клеток, а также для разделения неоднородных жидкостей (эмульсий, суспензий) с помощью центробежной силы. В микробиологических лабораториях применяются центрифуги, работающие при различных скоростях.

7. Прибор для счета колоний. Представляет собой полуавтоматический счетчик, снабженный иглой с пружинным устройством.

Универсальным инструментом для производства посевов является бактериальная петля. Кроме нее, используют иглу, а для посевов на среды в чашках Петри – ме­таллические и стеклянные шпатели.

Для посевов жидких материалов, кроме петли, используют пастеровские и градуированные пипетки. На практических занятиях студент получает бактериальные культуры в пробирках на питательных средах, с целью извлечь оттуда необходимые для исследования микроорганизмы, либо пересева их с одной среды в другую. То и другое производится при помощи петли, допускающей быструю стерилизацию на огне (быстро накаляется и быстро остывает) без повреждения метал­ла. При этом петлю держат в пламени вертикально для того, чтобы проволока на всем протяжении была одновременно нака­лена добела. Затем слегка обжигают и ближайший к проволоке металлический петледержатель.

Для приготовления препарата исследуемый материал берут бактериологической петлей (предварительно простерилизовать в пламени горелки).

При взятии материала из пробирки с бактериальной куль­турой петлю прожигают в пламени горелки до покраснения, держа ее в правой руке за петледержатель. Затем берут пробирку в левую руку так, чтобы видеть всю поверхность питательной среды.

Для изучения морфологии бактерий пользуются микроскопией. При этом исследованию могут подвергаться как живые, так и убитые микроорганизмы. В зависимости от величины микроорганизм можно рассматривать при помощи сухих объективов или под иммерсионными системами.

Микроскопы и методы микроскопии

Для микробиологических исследований используют несколько типов микроскопов (биологический, люминесцентный, электронный) и специальные методы микроскопии (фазово-контрастный, темнопольный).

Биологический микроскоп. В микробиологической практике широко применяют микроскопы отечественного производства. Предельная разрешающая способность иммерсионного микроскопа равна 0,2 мкм. Общее увеличение микроскопа определяется произведением увеличения объектива на увеличение окуляра.

Фазово-контрастная микроскопия основана на превращении изменения по фазе, возникающего при прохождении световой волны через так называемые фазовые (прозрачные) объекты, в изменения по амплитуде, которые улавливаются глазом.

С помощью фазово-контрастного приспособления фазовые изменения световых волн, проходящих через объект, превращаются в амплитудные и прозрачные объекты, становятся видимыми в микроскоп. Прозрачные биологические объекты при фазово-контрастной микроскопии приобретают высокую контрастность изображения, которая может быть позитивной или негативной.

Люминесцентная (или флюоресцентная) микроскопия основана на явлении фотолюминесценции.

Первичная (собственная) люминесценция наблюдается без предварительного окрашивания объекта; вторичная (наведенная) люминесценция возникает после окраски препаратов специальными люминесцирующими красителями – флюорохромами.

Электронная микроскопия делает возможным наблюдение объектов, размеры которых лежат за пределами разрешающей способности светового микроскопа (0,2 мкм). Электронный микроскоп применяется для изучения вирусов, тонкого строения различных микроорганизмов, макромолекулярных структур и других субмикроскопических объектов.

Методические указания

Правила работы с микроскопом. Работа с микроскопом состоит из правильной установки освещенности поля зрения и препарата, и его микроскопии разными объективами. Освещение может быть естественным (дневным) или искусственным. Для искусственного освещения используют специальные источники света, например, осветитель ОИ-7.

При микроскопии препаратов с иммерсионным объективом следует:

1. на приготовленный и окрашенный мазок нанести небольшую каплю иммерсионного масла и поместить препарат на предметный столик (укреплять зажимами не обязательно);

2. повернуть револьвер и установить иммерсионный объектив 90, осторожно опустить тубус микроскопа вниз до погружения фронтальной линзы иммерсионного объектива в каплю масла;

3. установить ориентировочный фокус при помощи макрометрического винта; нельзя допускать соприкосновения объектива с препаратом, которое может повлечь поломку препарата или фронтальной линзы (свободное расстояние иммерсионного объектива 0,1-1 мм).

Окончательную фокусировку препарата производят микрометрическим винтом, которые рекомендуется вращать не более чем в пределах одного оборота.

После окончания работы микроскоп необходимо привести в порядок. Специальный тряпочкой тщательно вытирают масло с иммерсионного объектива, переводят револьвер на малый сухой объектив 8.

Порядок работы с фазово-контрастным устройством:

1. Установить в микроскопе фазовый конденсор и необходимый фазовый объектив. Револьвер конденсора поставить в положение «0».

2. Поместить препарат на предметный столик.

3. Установить освещение, чтобы четкое изображение нити электролампы находилось в плоскости, полностью открытой ирис-диафрагмы конденсора.

4. Заменить окуляр на вспомогательный микроскоп МИР-4 и перемещением его окуляра сфокусировать фазовое кольцо объектива до получения четкого темно-серого изображения.

5. Установить диафрагму в соответствии с фазовым объективом. В поле зрения появляется светлое кольцо диафрагмы.

6. С помощью центрировочных винтов конденсора полностью совместить светлое и темное кольца.

7. Заменить вспомогательный микроскоп окуляром и микроскопировать препарат.

8. При смене объектива или препарата вновь проверить центрировку кольцевой диафрагмы с фазовым кольцом.

Правильное выполнение всех условий обеспечивает достаточно высокую контрастность изображения.

Техника темнопольной микроскопии:

1. Заменить обычный конденсор в микроскопе на темнопольный (параболоид- или кардиоид-конденсор).

2. Для создания оптически гомогенной среды на верхнюю линзу темнопольного конденсора нанести каплю иммерсионного масла. Поднять конденсор до соприкосновения капли масла с предметным стеклом.

3. Установить достаточно сильный и стабильный источник света (например, осветитель ОИ-7) и провести точную юстировку осветительной системы микроскопа.

Возможные ошибки при микроскопии в темном поле связаны с наличием пузырьков воздуха между конденсором и предметным стеклом, неправильной установкой конденсора и другими причинами.

Техника люминесцентной микроскопии. В повседневной работе обычно пользуются освещением объекта сверху, через объектив в падающем свете. При этом используют синие светофильтры ФС-1 (2 мм) и ФС-2 (4 мм), которые устанавливают в соответствующие гнезда на правой стороне штатива микроскопа. В качестве желтого запирающего фильтра для защиты глаза используют фильтр ЖС-18, который вмонтирован в барабан, находящийся над револьвером микроскопа МЛ-2. Цифра «1» на барабане, обращенная в сторону исследователя, соответствует фильтру ЖС-18.

При работе с микроскопом МЛ-2 необходимо:

1. включить вилку блока питания микроскопа в электрическую сеть;

2. поворотом по часовой стрелке установить рукоятку регулятора напряжения у красной точки;

3. тумблер на лицевой стороне блока питания установить в положение «ВКЛ» (включено и нажать кнопку зажигания лампы микроскопа; если лампа не загорается, повернуть рукоятку регулятора напряжения на несколько миллиметров по часовой стрелке и вновь нажать кнопку (на кнопку нажимать не более 2-3 с);

4. после зажигания лампы установить рукоятку регулятора рабочего тока на отметку в 4 А; через 10 мин после включения лампы микроскопа можно начинать исследование препаратов.

При работе с опак-иллюминатором ОИ-17 следует:

1) укрепить опак-иллюминатор в тубусном гнезде головки микроскопа и сверху установить тубус;

2) отцентрировать лучи ртутно-кварцевой лампы в отношении опак-иллюминатора;

3) перед источником света поместить два синих светофильтра; для защиты глаз на окуляр надеть желтый светофильтр.

Препарат помещают на предметный столик микроскопа, револьвер с объективами устанавливают в требуемое положение и добиваются фокусировки исследуемого объекта с помощью макро- и микровинта.

Люминесцентную микроскопию проводят в затемненной комнате.

Методы приготовления препаратов для темнопольной, фазово-контрастной и люминесцентной микроскопии. Для темнопольной и фазово-контрастной микроскопии приготавливают препарат «раздавленная» капля. Микроскопируют препарат с объективом 40 или специальным иммерсионным объективом с ирис-диафрагмой, позволяющей регулировать численную апертуру от 1,25 до 0,85.

Толщина предметных стекол не должна превышать 1-1,5 мм, покровных – 0,15-0,2 мм.

Для люминесцентной микроскопии готовят на предметных стеклах препараты-мазки или «раздавленная» капля, которые флюорохромируют специальными красителями: акридиновым желтым, акридиновым оранжевым, ауромином, корифосфином в разведении 1:10 000 и более. При работе с иммерсионным объективом используют нефлюоресцирующее масло.

Приготовление препаратов для исследования в электронном микроскопе. Приготовление и исследование препаратов в электронном микроскопе имеет ряд особенностей. Препараты приготавливают на специальных пленках-подложках, так как стекло непроницаемо для электронов. Исследуемый объект максимально очищают от посторонних примесей, наносят на пленку-подложку, предварительно помещенную на опорную металлическую сеточку, и изучают в электронном микроскопе.