Выщепление 5' концевой метки (TaqMan Assay).

TaqMan ПЦР основан на использовании 5'-экзонуклеазной активности полимеразы. В реакционную смесь добавляют ДНК-пробы, меченные на 5'-конце флуоресцентным красителем, а на 3'-конце — фосфатной группой и гасителем флуоресценции (Рис.7.). Пробы комплементарны участку амплифицируемой области. Гаситель поглощает испускаемое флуоресцентной меткой излучение, а фосфатная группа в 3'-положении блокирует полимеразу.

Рис.7. Схема ПЦР «в реальном времени с использованием TagMan

При отжиге праймеров проба количественно связывается с комплементарным участком ДНК. Во время стадии элонгации полимераза синтезирует комплементарную цепь ДНК и, дойдя до участка, гибридизованного с пробой, начинает расщеплять пробу за счет 5'-экзонуклеазной активности. В результате флуоресцентная метка отделяется от гасителя, и ее свечение может быть детектировано. Таким образом, увеличение флуоресценции будет прямо пропорционально количеству наработанного ПЦР-продукта.

Использование зондов с комплементарными концевыми последовательностями (molecular beacons)

Molecular Beacons отличается от TaqMan тем, что концы пробы (на которых находятся соответственно метка и тушитель флуоресценции) комплементарны друг другу (Рис.8.). В результате, при температуре отжига праймеров они схлопываются и образуют структуру типа "ручки сковородки" (stem-loop), где зона комплементарности пробы с матрицей находится в петле.

Рис.8. Схема ПЦР «в реальном времени с использованием Molecular Beacons

При гибридизации пробы с матрицей вторичная структура разрушается, флуоресцентная метка и тушитель расходятся в разные стороны, и флуоресценция от метки может быть детектирована.

Применение 2-х зондов с резонансным переносом энергии (LightCycler assay)

В методике Light Cycler используется две пробы, меченые флуоресцентной меткой. Принцип метода заключается в переносе энергии от одного флуорофора, находящегося на 3' конце первой пробы, ко второму флуорофору, находящемуся на 5' конце второй пробы, который происходит в том случае, когда расстояние между флуорофорами составляет 1-3 нуклеотида (Рис.9.).

Технологии Molecular beacons и LightCycler стоят ощутимо дороже, и их осмысленно применять лишь в том случае, когда требуется крайне специфичная детекция лишь одного из образующихся ПЦР-продуктов (например, при анализе SNP).

Рис.9. Схема ПЦР «в реальном времени» с использованием LightCycler assay

Обычно SYBR Green хорошо работает примерно до C(T) = 35-37, затем точность начинает падать. Диапазон достоверности результатов легко проверить для каждой конкретной пары праймеров, проведя несколько независимых real-time PCR.

TaqMan необходим также, когда требуется проконтролировать в одной пробирке образование нескольких PCR-продуктов, как с одной пары праймеров, так и с нескольких. Однако нужно иметь в виду, что увеличение количества реакций в одной пробирке значительно усложняет оптимизацию, поэтому без необходимости это делать не рекомендуется.