Количественный и качественный анализ нк

Качественный анализ НК можно провести с помощью агарозного гель-электрофореза (см. Гл.3.).

Концентрацию нуклеиновых кислот в растворе можно рассчитать, измерив его оптическую плотность при 260 нм. Одна единица оптической плотности примерно соответствует двухцепочечной ДНК 50 мкг/мл и концентрации одноцепочечной ДНК и РНК 40 мкг/мл.

Для оценки степени очистки образцов ДНК от белковых примесей можно использовать отношение между оптической плотностью при 260 и 280 нм. Для чистых препаратов ДНК и РНК оно должно быть 1,8 и 2, соответственно. Если отношение меньше, значит образцы загрязнены белками или фенолом, и оценка концентрации будет неверной. В этом случае необходимо повторить обработку протеиназой К и экстракцию фенолом/хлороформом.

2. Полимеразная цепная реакция синтеза днк и ее модификации

В последние годы все больше молекулярно-биологических методов находят практическое применение в различных областях медицины, промышленности и сельского хозяйства. Один из таких методов полимеразная цепная реакция (ПЦР) – это метод, имитирующий естественную репликацию ДНК и позволяющий обнаружить единственную специфическую молекулу ДНК в присутствии миллионов других молекул. Основные принципы использования праймеров (коротких искусственно синтезированных молекул ДНК) и состав ингредиентов, входящих в реакционную смесь для получения копий ДНК, впервые были описаны Kleppe с соавт. в 1971 году. Однако тогда еще не была продемонстрирована основная черта ПЦР - экспоненциальное увеличение количества копий фрагмента исходной ДНК как результат реакции. В 1983 году сотрудник фирмы «Cetus» Kary Mullis предложил метод, ставший в дальнейшем известным как полимеразная цепная реакция (ПЦР). Суть метода заключается в многократном копировании (амплификации) в пробирке определенных участков ДНК в процессе повторяющихся температурных циклов. На каждом цикле амплификации синтезированные ранее фрагменты вновь копируются ДНК-полимеразой. Благодаря этому происходит многократное увеличение количества специфических фрагментов ДНК, что значительно упрощает дальнейший анализ. Следует отметить, что этому открытию сопутствовало развитие некоторых технологий. В частности, появление приборов, позволяющих автоматически синтезировать одноцепочечные фрагменты ДНК (олигонуклеотиды). В тот же период были обнаружены уникальные микроорганизмы, живущие в гейзерах. Их ферментативная система, в частности ДНК-полимераза, выдерживает высокие температуры горячих источников и сохраняет свою биологическую активность вплоть до 95°С, что является необходимым условием для проведения полимеразной цепной реакции. Результатом открытия ПЦР стало почти немедленное практическое применение метода. В 1985 году Saiki с соавт. опубликовали статью, в которой была описана амплификация геномной последовательности β-глобина. С этого момента количество публикаций, в которых авторы сообщали о применении ПЦР в своих работах, стало увеличиваться в геометрической прогрессии. Метод приобрел такую популярность, что сегодня уже трудно представить работу в области молекулярной биологии без его использования. Особенно бурное развитие метод полимеразной цепной реакции получил благодаря международной программе «Геном человека». Были созданы современные лазерные технологии секвенирования (расшифровки нуклеотидных последовательностей ДНК). Если в недавнем прошлом для расшифровки последовательности ДНК размером в 250 пар нуклеотидов (п.н.) требовалась неделя, то современные лазерные секвенаторы позволяют определять до 5000 п.н. в день. Это в свою очередь способствует значительному росту информационных баз данных, содержащих последовательности ДНК различных биологических объектов. В настоящее время предложены различные модификации ПЦР, показана возможность создания тест-систем для обнаружения микроорганизмов, выявления точечных мутаций, описаны десятки различных применений метода.

Что же может ПЦР? Основные медицинские области применения этого метода – диагностика инфекций и наследственных заболеваний. ПЦР открывает поистине широкие возможности анализа генома человека – выявления дефектных генов, определяющих наследственную предрасположенность к заболеваниям. Вместе с тем, интересно и обнаружение генов, несущих информацию о полезных признаках. Например, генов, снижающих риск опухолевого перерождения тканей, или генов, значительно уменьшающих вероятность заражения ВИЧ-инфекцией. ПЦР используется также при генетической идентификации личности, определении степени родства. Только результат анализа ДНК позволяет окончательно дать заключение о достоверности отцовства.