- •© БашГу, 2013 содержание
- •Введение
- •Выделение нуклеиновых кислот
- •Выделение днк
- •Этап подготовки пробы биологического материала
- •Методы выделения днк
- •Основные этапы методов выделения днк
- •Выделение днк фенол-хлороформной экстракцией
- •Методика выделения днк методом фенол-хлороформной экстракции из лейкоцитов крови (Mathew c.C., 1984).
- •Выделение днк с помощью сорбента
- •Выделение днк с помощью бумажных фильтров
- •Выделение рнк
- •Выделение рнк из цельной крови
- •Методика выделения рнк из цельной крови (с использованием набор реагентов ооо нпф «Литех»):
- •Выделение рнк из тканей с использованием тризола
- •Количественный и качественный анализ нк
- •Полимеразная цепная реакция синтеза днк и ее модификации
- •Механизм, компоненты и методика проведения пцр Механизм пцр
- •Этапы пцр
- •Компоненты реакционной пцр-смеси
- •Основные принципы работы пцр-лаборатории
- •Рекомендации по оборудованию лаборатории
- •Рекомендации по подготовке к постановке пцр
- •Стандартная методика для проведения пцр
- •Методика проведения пцр
- •Проблема контаминации
- •2.2. Пцр в режиме реального времени
- •Принципы пцр в «реальном времени»
- •Различные типы пцр «в реальном времени»
- •Использование интеркалирующих агентов
- •Использование меченых флуоресцентными агентами олигонуклеотидных проб, комплементарных участку пцр-продукта
- •Выщепление 5' концевой метки (TaqMan Assay).
- •Использование зондов с комплементарными концевыми последовательностями (molecular beacons)
- •Применение 2-х зондов с резонансным переносом энергии (LightCycler assay)
- •Сравнение методов sybr Green и TagMan
- •Материально-техническое обеспечение (Используемое оборудование и материалы для проведения пцр «в реальном времени»)
- •Основные этапы работ
- •Базовые параметры реакции
- •Базовый протокол TaqMan амплификации
- •Проведение полимеразной цепной реакции в реальном времени
- •Способ учета результатов
- •Анализ результатов
- •Пример протокола реакции для амплификатора Bio-Rad cfx 96
- •Пцр с обратной транскрипцией
- •Протокол проведения процедуры обратной транскрипции
- •Электрофорез днк
- •Методика заливки агарозного геля
- •Определение концентрации и качества днк/мРнк в агарозном геле
- •Полиморфизм длины рестрикционных фрагментов (пдрф-анализ)
- •5. Анализ конформационного п олиморфизма однонитевой днк (sscp-анализ)
- •6. Секвенирование
- •Порядок подготовки образцов днк к секвенированию.
- •1Мкл буфер BigDye
- •Современные методы полногеномного секвенирования днк
- •5. Метод биочипов
- •Основные технологии производства днк-микрочипов
- •Оценка экспрессии генов с помощью днк микрочипов (на примере Affymetrix GeneChip)
- •Полногеномное генотипирование полиморфных локусов с помощью микрочипов высокой плотности (на примере Illumina Human610-Quad BeadChip)
- •Список использованной литературы
- •Приготовление рективов для выделения днк Приготовление лизирующего буфера
- •Приготовление Трис-нСl 2 m (pH 7,6)
- •Приготовление 0,5 м эдта (рН 8,0)
- •Приготовление Soline (эдта)
- •Приготовление 5 м NaCl
- •Приготовление 10% sds (додецил сульфат натрия)
- •Приготовление фенола
- •Компоненты и реактивы для прведения электрофореза днк
- •Приготовление реактивов, неоходимых при проведении sscp-анализа
- •Триплетный генетический код
- •Биолоические базы данных
Основные этапы работ
Подготовка образцов ДНК для полимеразной цепной реакции.
Проведение полимеразной цепной реакции «в реальном времени»
Анализ результатов полимеразной цепной реакции «в реальном времени».
Базовые параметры реакции
- Праймеры - 300 nM каждый; - зонд (для TaqMan) - 250 nM; - MgCl2 - 5 nM (SYBR Green), 3.5 nM (TaqMan); - полимераза - AmpliTaqGold, Applied Biosystems.
Таблица 3. Базовый протокол SYBR Green амплификации
Шаг |
Время |
Темпратура |
1 |
8 мин |
94 OC |
2 |
30 сек |
94 OC |
3 |
20 сек |
60-65 OC |
4 |
1 мин |
72 OC |
5 |
Plate read (анализ образцов) |
|
6 |
Go to 2 for 39 times (повторять с 2 температуры 39раз) |
|
7 |
Melting curve from 60OC to 94OC read every 0.2OC hold for 1 sec before plate read (Температура плавления от 60 OC до 94 OC измеряется каждые 0,2 OC за 1 сек до стадии Plate read) |
|
8 |
Forever 10 OC (Хранение 10 OC) |
|
Англ. язык приведен для облегчения работы с англоязычным интерфейсом программного обеспечения прибора
Примечания
Для того, чтобы предотвратить образование димеров праймеров, стадия отжига должна быть как можно короче. Как правило, 15-20 сек вполне достаточно для отжига праймеров на специфическом субстрате, однако в определенных случаях время отжига приходится удлинять.
При образовании димеров детекцию флуоресценции (Plate read) можно проводить не при 72OC, а при температурах выше температуры плавления димеров (подробнее см. ниже).
Поскольку SYBR Green, как правило, дает достоверные результаты при C(T) не больше 35-38, 40 циклов амплификации является оптимальным значением.
Полимераза AmpliTaqGold может работать и при 60OC, поэтому теоретически вместо пп. 3 и 4 можно использовать 1 min & 60-65OC, но такой протокол будет в большей степени способствовать образованию димеров.
Кривую плавления (melting curve) двуцепочечной ДНК необходимо строить при работе с SYBR Green для определения специфичности PCR. Кроме того, при отладке реакции рекомендуется проанализировать PCR-продукты в агарозном электрофорезе.
Таблица 4.
Базовый протокол TaqMan амплификации
Шаг |
Время |
Температура |
1 |
10 мин |
94OC |
2 |
15 сек |
94OC |
3 |
|
60OC |
4 |
1 мин |
72 OC |
5 |
Plate read (анализ образцов) |
|
6 |
Go to 2 for 39 times (повторять с 2 температуры 39раз) |
|
7 |
Forever 10 OC (Хранение 10 OC) |
|
Примечания
Applied Biosystems включает в стандартный буфер урацил-N-гликозилазу, а вместо dTTP использует dUTP, для защиты от загрязнения стока PCR-продуктом. Для того чтобы активировать урацил-N-гликозилазу, необходимо начать реакцию с инкубации 2 min при 50OC.
Построение кривой плавления после реакции не обязательно (напомним, что это будет кривая плавления не PCR-продуктов, а дуплекса зонда с ампликоном). Однако это может быть полезным для анализа полиморфизмов, так как температура плавления дуплекса может различаться в зависимости от степени комплементарности. Таким образом, несколько пиков плавления на графике будут указывать на полиморфизм в участке ампликона, комплементарном зонду.