Выделение днк с помощью бумажных фильтров

В основе подобных фильтров (например, FTA Whatman) расположен целлюлозный фильтр, пропитанный смесью сильных буферов, которые лизируют образцы и связывают НК, а белки денатурируются. НК защищаются от действия нуклеаз и ультрафиолета. Уничтожается фермент ДНК-аза, разрушающая ДНК.

Преимущества метода экстракции на бумажных фильтрах:

- безопасное обращение с образцами (карта инактивирует микробы, в том числе переносимые кровью патогены);

- быстрое выделение высококачественного образца ДНК;

- длительное хранение образцов при комнатной температуре (карта препятствует росту бактерий и других микроорганизмов);

- пригодность для большинства образцов жидкого вида (кровь, слюна, сперма, свежий костный мозг);

- возможность автоматизации (ДНК можно амплифицировать непосредственно с бумажного перфората);

Недостатки метода экстракции на бумажных фильтрах:

- повышенная стоимость по сравнению с ручными методами;

- пригодность только для образцов жидкого типа;

- количество ДНК на перфорате невозможно подвергнуть количественному анализу или скорректировать;

- потенциальная нестабильность ДНК и ее деградация со временем;

- полученная ДНК – одноцепочечная, нельзя использовать для ПДРФ-анализа;

Выделение ДНК с помощью магнитных частиц

К исследуемым образцам добавляют лизирующий буфер и магнитные шарики, с которыми связывается выделяемая ДНК. Элюирование ДНК осуществляют с помощью низкосолевого буфера.

Преимущества метода экстракции с помощью магнитных частиц:

- большая емкость сорбента, позволяющая выделять большие количества НК;

- миниминизация потерь в ходе выделения (нет необходимости разделения фаз, не требуется осаждение материала);

- высокая чистота конечного продукта;

Недостатки метода экстракции с помощью магнитных частиц:

- дороговизна.

2. Выделение рнк

Методы выделения ДНК и РНК в принципе не различаются, варьируют лишь некоторые методологические приемы. Для выделения РНК проводят лизис клеток, депротеинизацию клеточного лизата и отделение РНК от ДНК. Однако необходимо помнить, что РНК по сравнению с ДНК гораздо более лабильна и чувствительна к действию нуклеаз. Кроме того, РНКазы менее чувствительны к действию денатурирующих белки веществ, чем ДНКазы. Все это затрудняет получение полноразмерной РНК и заставляет проводить инактивацию РНКаз одновременно с лизисом. Необходимо принять все меры предосторожности для предотвращения случайного попадания РНКаз из других источников, которыми могут быть кожа человека, распространяющиеся с воздухом бактерии и грибы.

Выделение рнк из цельной крови

Применение фенола и хлороформа при выделении ДНК способствует созданию двухфазной системы. Фенол отделяет белки от ДНК. Хлороформ денатурирует белок и липиды и помогает поддерживать разделение органической и водной фазы, а также делает ДНК менее растворимой в феноле.

Первый этап фенол-хлороформной экстракции РНК из крови подобен таковому при выделении ДНК. Метод выделения РНК на этапе непосредственного применения фенола с хлороформом отличается тем, что при рН=7-8 происходит растворение ДНК и РНК в водной фазе, в то время как белки образуют непрозрачный слой между фазами. В кислых условиях (рН<5), суммарная РНК остается в верхней водной фазе, в то время как большая часть ДНК и белков остается или в интерфазе, или в органической фазе.

Суммарную РНК впоследствии можно выделить осаждением с изопропиловым спиртом. Регулируя содержание фенола и его рН, можно добиться разделения ДНК и РНК между собой, при этом ДНК будет находиться в органической фазе, в то время как РНК будет в водной фазе. На данной стадии возможно добавление изоамилового спирта, чтобы предотвратить вспенивание. LiCl используется для денатурации РНК, при этом эффективно удаляются ДНК, белки, углеводы и нуклеотидфосфаты.

Для выделения РНК необходимо собрать в одноразовую пробирку с 200 мкл раствора антикоагулянта (0,05М раствор ЭДТА или 4% раствор цитрата натрия) 2 мл венозной крови (гепарин не использовать!). Неохлажденные пробы хранить при +4 - +8⁰С не более суток. Не замораживать!