Приготовление фенола

Этап

Реагент

Количество

I Расплавить твердый фенол при 68⁰ в водяной бане

II

8-оксихинолин

до конечной концентрации 0,1% (антиоксидант)

III

Буфер (Трис-HCl pH 8,0 в смеси 0,2% 6-меркаптоэтанола)

насыщают равным объемом до рН 7,6

IV Хранить не более 1 месяца при t = +4⁰C

Проблема

Возможная причина

Возможные способы решения

Шмер по дорожке с

гелем

1.Деградирует продукт

2. Неспецифичная амплификация

3. Избыток ДНК-матрицы

1. Найдите источник загрязнения нуклеазами; убедитесь, что материал не хранился долго и повторите ПЦР;

2. Подберите более специфичные праймеры или более оптимальные условия реакции;

3.Возьмите меньшие количества ДНК-матрицы.

Не специфические полосы по дорожке на геле

1. Неспецифическая амплификация

2. Избыток ДНК-матрицы

1. Подберите более специфичные праймеры или более оптимальные условия реакции;

2. Возьмите меньшие количества ДНК-матрицы.

Полоса продукта слабая или отсутствует

1. Слабо покрашен гель

2. Отсутствует ДНК-матрица в пробе

3. Деградировали праймеры

4. Праймеры не отжигаются на ДНК-матрице

5. Неправильные условия проведения ПЦР

6. Вышел из строя амплификатор.

1. Добавьте в агарозу больше бромистого этидия;

2. Добавьте ДНК-матрицу

3. Синтезируйте новые праймеры;

4. Подберите более специфичные праймеры;

5. Подберите более оптимальные условия ПЦР;

6. Замените амплификатор

Компоненты

На 15 мл

На 30 мл

На 40 мл

На 45 мл

На 50 мл

7% ПААГ

30% акриламид

3,5 мл

7 мл

9,3 мл

10,5 мл

11,7 мл

10хТВЕ

1,5 мл

3 мл

4 мл

4,5 мл

5 мл

ТЕМЕД

15 мкл

30 мкл

40 мкл

45 мкл

50 мкл

10% ПСА

133 мкл

266 мкл

355 мкл

400 мкл

443 мкл

Н₂0

до 15 мл

до 30 мл

до 40 мл

до 45 мл

до 50 мл

8% ПААГ

30% акриламид

4 мл

8 мл

10,7 мл

12 мл

13,3 мл

10хТВЕ

1,5 мл

3 мл

4 мл

4,5 мл

5 мл

ТЕМЕД

15 мкл

30 мкл

40 мкл

45 мкл

50 мкл

10% ПСА

133 мкл

266 мкл

355 мкл

400 мкл

443 мкл

Н₂0

до 15 мл

до 30 мл

до 40 мл

до 45 мл

до 50 мл

10% ПААГ

30% акриламид

5 мл

10 мл

13,3 мл

15 мл

16,7 мл

10хТВЕ

1,5 мл

3 мл

4 мл

4,5 мл

5 мл

ТЕМЕД

15 мкл

30 мкл

40 мкл

45 мкл

50 мкл

10% ПСА

133 мкл

266 мкл

355 мкл

400 мкл

443 мкл

Н₂0

до 15 мл

до 30 мл

до 40 мл

до 45 мл

до 50 мл

Компоненты

На 100 мл

На 200 мл

Акриламид

29 г

58 г

Метиленбисакриламид

1 г

2 г

Компоненты

На 1 л

На 0,5 л

Трис

108 г

54 г

Борная кислота

55 г

27,5 г

0,5 М ЭДТА рН=8 (или сухой)

40 мл

(9,3 г)

20 мл

(4,65 г)

Компоненты

На 1 л

На 0,5 л

Трис

48,4 г

24,2 г

ЛУК

11,2 мл

5,6 г

0,5 М ЭДТА рН=8

20 мл

10 мл

рН доводим до 7,8 ледяной уксусной кислотой

Реагент

Количество

AgNO₃

1,8 г

Н₂О

до 2000 мл

Реагент

Количество

40% раствор формалина

15 мл

NaOH сухой

15 г

Н₂О

до 500 мл

Фермент типа II

Сайт узнавания

Симметричный (N=6)

Bal I

TGG|CCA

Bam HI

G|GATCC

Bcl I

T|GATCA

Bgl II

A|GATCT

Eco RI

G|AATTC

Hin dIII

A|AGCTT

Hpa I

GTT|AAC

Kpn I

GGTAC|C

Pst I

CTGCA|G

Pvu II

CAG|CTG

Sma I

CCC|GGG

Sac I

GAGCT|C

Sac II

CCGC|GG

Sal I

G|TCGAC

Xba I

T|CTAGA

Xho I

CTC|GAG

Вырожденный симметричный (N=6)

Acc I

GT|(A/C)(G/T)AC

Ava I

C|PyCGPuG

Hae I

(A/T)GG|CC(T/A)

Hae II

PuGCGC|Py

Hgi AI

G(T/A)GC(T/A)|C

Hin dII

GTPy|PuAC

Симметричный (N=5)

Asu I

G|GNCC

Ava II

G|G(A/T)CC

Eco RII

|CC(A/T)GG

Hin fI

G|ANTC

Симметричный (N=4)

Alu I

AG|CT

Fnu DII

CG|CG

Hae III

GG|CC

Hha I

GCG|C

Hpa II

C|CGG

Mbo I

|GATC

Taq I

T|CGA

Симметричный метилированный (N=4)

Dpn I

C^mATC

Msp I

C(^mC/C)GG