- •© БашГу, 2013 содержание
- •Введение
- •Выделение нуклеиновых кислот
- •Выделение днк
- •Этап подготовки пробы биологического материала
- •Методы выделения днк
- •Основные этапы методов выделения днк
- •Выделение днк фенол-хлороформной экстракцией
- •Методика выделения днк методом фенол-хлороформной экстракции из лейкоцитов крови (Mathew c.C., 1984).
- •Выделение днк с помощью сорбента
- •Выделение днк с помощью бумажных фильтров
- •Выделение рнк
- •Выделение рнк из цельной крови
- •Методика выделения рнк из цельной крови (с использованием набор реагентов ооо нпф «Литех»):
- •Выделение рнк из тканей с использованием тризола
- •Количественный и качественный анализ нк
- •Полимеразная цепная реакция синтеза днк и ее модификации
- •Механизм, компоненты и методика проведения пцр Механизм пцр
- •Этапы пцр
- •Компоненты реакционной пцр-смеси
- •Основные принципы работы пцр-лаборатории
- •Рекомендации по оборудованию лаборатории
- •Рекомендации по подготовке к постановке пцр
- •Стандартная методика для проведения пцр
- •Методика проведения пцр
- •Проблема контаминации
- •2.2. Пцр в режиме реального времени
- •Принципы пцр в «реальном времени»
- •Различные типы пцр «в реальном времени»
- •Использование интеркалирующих агентов
- •Использование меченых флуоресцентными агентами олигонуклеотидных проб, комплементарных участку пцр-продукта
- •Выщепление 5' концевой метки (TaqMan Assay).
- •Использование зондов с комплементарными концевыми последовательностями (molecular beacons)
- •Применение 2-х зондов с резонансным переносом энергии (LightCycler assay)
- •Сравнение методов sybr Green и TagMan
- •Материально-техническое обеспечение (Используемое оборудование и материалы для проведения пцр «в реальном времени»)
- •Основные этапы работ
- •Базовые параметры реакции
- •Базовый протокол TaqMan амплификации
- •Проведение полимеразной цепной реакции в реальном времени
- •Способ учета результатов
- •Анализ результатов
- •Пример протокола реакции для амплификатора Bio-Rad cfx 96
- •Пцр с обратной транскрипцией
- •Протокол проведения процедуры обратной транскрипции
- •Электрофорез днк
- •Методика заливки агарозного геля
- •Определение концентрации и качества днк/мРнк в агарозном геле
- •Полиморфизм длины рестрикционных фрагментов (пдрф-анализ)
- •5. Анализ конформационного п олиморфизма однонитевой днк (sscp-анализ)
- •6. Секвенирование
- •Порядок подготовки образцов днк к секвенированию.
- •1Мкл буфер BigDye
- •Современные методы полногеномного секвенирования днк
- •5. Метод биочипов
- •Основные технологии производства днк-микрочипов
- •Оценка экспрессии генов с помощью днк микрочипов (на примере Affymetrix GeneChip)
- •Полногеномное генотипирование полиморфных локусов с помощью микрочипов высокой плотности (на примере Illumina Human610-Quad BeadChip)
- •Список использованной литературы
- •Приготовление рективов для выделения днк Приготовление лизирующего буфера
- •Приготовление Трис-нСl 2 m (pH 7,6)
- •Приготовление 0,5 м эдта (рН 8,0)
- •Приготовление Soline (эдта)
- •Приготовление 5 м NaCl
- •Приготовление 10% sds (додецил сульфат натрия)
- •Приготовление фенола
- •Компоненты и реактивы для прведения электрофореза днк
- •Приготовление реактивов, неоходимых при проведении sscp-анализа
- •Триплетный генетический код
- •Биолоические базы данных
Список использованной литературы
Бочков Н.П. Клиническая генетика. М. 2011. – 592 с.
Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. — Москва: Мир, 2002. — 589 с.
Горбунова В.Н., Баранов В.С. Введение в молекулярную диагностику и генотерапию наследственных заболеваний. Санкт-Петербург. «Специальная Литература». 1997. – 287 с.
Дейвис К. Анализ генома. Методы. М. 1990. – 246 с.
Епринцев А.Т., Попов В.Н., Федорин Д.Н. Идентификация и исследование экспрессии генов. // Учебно-методическое пособие для ВУЗов. – Воронеж. – 2008. – 63 с.
Жимулев И.Ф. Общая и молекулярная генетика. Н. 2003. – 479 с.
Инге-Вечтомов С.Г. Генетика с основами селекции. М. - 2010. – 718 с.
Кузьмина Н.А. Основы биотехнологии, 2005 // http://www.biotechnolog.ru/
Кулмамабетова Г. Пробоподготовка. Методы выделения ДНК/РНК // Современные проблемы биологии, ЕНУ, Астана, 2012, Лекция 9.
Меньшикова В.В. Клинико-лабораторные аналитические технологии и оборудование. М. 2007. – 240 с.
Молекулярная биотехнология. Принципы и применение / под ред. Н.К. Янковского. – М. : Мир, 2002. – 588 с
Молекулярная клиническая диагностика. Методы / под ред. С.Херрингтона, Дж.Макги. – М.: Мир, 1999. – 558с.
Мутовин Г.Р. Клиническая генетика. Геномика и протеомика неследственной патологии: учебное пособие. М. 2010. – 832 с.
Мухачева Т.А., Ковалев С.Ю. Прикладная биоинформатика. Спецкурс. УрФУ, г. Екатеринбург. 2012.
Патрушев Л.И. Экспрессия генов. М. Наука. 2000. – 830 c.
Поляничко А. М. Электрофорез в ПААГ. Методическое пособие. Санкт-Петербург. 2007.
Притчард Д.Д. – Наглядная медицинская генетика. – пер. с англ. под ред. Н.П. Бочкова. – М.: ГЭОТАР-Медиа. – 2009. – 200с.
Пузырев В.П., Степанов В.А. Патологическая анатомия генома человека. Н. – 1997. – 224 с.
ПЦР в реальном времени / под ред. Д.В. Ребрикова. - М.: Бином., 2009. – 223с.
Северин Е.С. Биохимия: Учебник. М. 2004. – 784 с.
Сукачев М. Современные методы полногеномного секвенирования (расшифровки) ДНК в диагностике и лечении заболеваний // http://innoros.ru/publications/articles/13/
Телков М. PCR реального времени: методические основы, оптимизация, применение. Bio-Red Laboratories.
Теоретические основы полимеразной цепной реакции. НПО «ДНК-Технология» - Москва, 1998 // www.dna-technology.ru
Шатц В.Д., Сахартова О.В. Высоко-эффективная жидкостная хроматография. Основы теории. Методолгия. Применение в лекарственной химии.
Mathew C.C. The isolation of high molecular weight eucariotic DNA// methods in molecular biology / ED. Walker J.M. – N.Y.: Haman press. – 1984. – P. 31–34.
Nolan T, Hands RE, Bustin SA (2006). «Quantification of mRNA using real-time RT-PCR.». Nat. Protoc. 1: 1559–1582. DOI:10.1038/nprot.2006.236. PMID 17406449.
VanGuilder HD, Vrana KE, Freeman WM (2008). «Twenty-five years of quantitative PCR for gene expression analysis». Biotechniques 44: 619–626. DOI:10.2144/000112776. PMID 18474036.
ПРИЛОЖЕНИЕ
Приложение 1.