Основные технологии производства днк-микрочипов

Производственные технологии и дизайн в наибольшей степени определяют достоинства и недостатки биологических микрочипов, области их применения, ценовые характеристики и общую доступность.

Существуют два принципиально разных подхода к производству ДНК–чипов: синтез ДНК заданной последовательности непосредственно на матрице и иммобилизация на подложке заранее синтезированных олигонуклеотидов химическим путем. Технология синтеза олигонуклеотидов на подложке фотолитографическим путем запатентована и применяется компанией Affymetrix, мировым лидером в области производства ДНК – чипов, контролирующим до 70% их мирового рынка. В основе технологии лежит применение фотолабильной защитной группы для мономерных звеньев ДНК, которая удаляется с концевого остатка синтезируемого на подложке олигонуклеотида при облучении УФ – светом. Достоинством такой технологии является возможность получения чипов с очень высокой плотностью нанесения – до 100 000 точек на 1 см2. Очевидный недостаток метода – сложность и дороговизна процесса.

Технологии химической иммобилизации фрагментов ДНК на твердых подложках начали разрабатываться около 30 лет назад и в настоящий момент продолжают совершенствоваться. Общий принцип иммобилизации биологических молекул – формирование на поверхности подложки и на конце пришиваемого олигонуклеотида пары химических групп, обеспечивающей образование между ними ковалентной связи. Существует огромное количество таких способов, большинство из которых основано на взаимодействии нуклеофильной группы (например, аминогруппы), находящейся на поверхности подложки или привязанной к молекуле олигонуклеотида, с электрофильным агентом, в роли которого могут выступать тем или иным путем активированные карбоновые кислоты, моноэфиры фосфорной кислоты и т.д.

Оценка экспрессии генов с помощью днк микрочипов (на примере Affymetrix GeneChip)

Наиболее часто ДНК-микрочипы применяются для оценки экспрессии генов. Наиболее популярная платформа для решения этого класса задач - микрочипы Affymetrix GeneChip, использующие короткие последовательности олигонуклеотидов для выявления генов, содержащихся в образце РНК. Присутствие в образце каждого гена фиксируется при помощи совокупности зондов длиной в 25 нуклеотидов каждый. Для улучшения качества эксперимента на чипе размещается несколько копий зондов на каждую рассматриваемую последовательность.

Микрочипы Affymetrix обычно используют от 11 до 20 пар проб на каждый изучаемый ген. Одна компонента таких пар, называемая perfect match probe (PM), в точности комплементарна последовательности соответствующего гена - подразумевается, что именно его РНК будет присоединяться к PM-зонду. Такое присоединение называется специфической гибридизацией. Тем не менее, к зондам могут присоединяться нуклеотидные последовательности и других генов (неспецифическая гибридизация). Для оценки воздействия неспецифической гибридизации используется другие компоненты пары - зонды, называемые mismatch probe (MM). Последовательность нуклеотидов в них совпадает с последовательностью в соответствующих PM-пробах с заменой центрального (тринадцатого) нуклеотида на комплементарный. Соотношение интенсивности свечения PM- и MM-проб изначально использовалось для нейтрализации эффекта неспецифической гибридизации, однако более поздние исследования поставили под сомнение правильность подобного подхода.