- •© БашГу, 2013 содержание
- •Введение
- •Выделение нуклеиновых кислот
- •Выделение днк
- •Этап подготовки пробы биологического материала
- •Методы выделения днк
- •Основные этапы методов выделения днк
- •Выделение днк фенол-хлороформной экстракцией
- •Методика выделения днк методом фенол-хлороформной экстракции из лейкоцитов крови (Mathew c.C., 1984).
- •Выделение днк с помощью сорбента
- •Выделение днк с помощью бумажных фильтров
- •Выделение рнк
- •Выделение рнк из цельной крови
- •Методика выделения рнк из цельной крови (с использованием набор реагентов ооо нпф «Литех»):
- •Выделение рнк из тканей с использованием тризола
- •Количественный и качественный анализ нк
- •Полимеразная цепная реакция синтеза днк и ее модификации
- •Механизм, компоненты и методика проведения пцр Механизм пцр
- •Этапы пцр
- •Компоненты реакционной пцр-смеси
- •Основные принципы работы пцр-лаборатории
- •Рекомендации по оборудованию лаборатории
- •Рекомендации по подготовке к постановке пцр
- •Стандартная методика для проведения пцр
- •Методика проведения пцр
- •Проблема контаминации
- •2.2. Пцр в режиме реального времени
- •Принципы пцр в «реальном времени»
- •Различные типы пцр «в реальном времени»
- •Использование интеркалирующих агентов
- •Использование меченых флуоресцентными агентами олигонуклеотидных проб, комплементарных участку пцр-продукта
- •Выщепление 5' концевой метки (TaqMan Assay).
- •Использование зондов с комплементарными концевыми последовательностями (molecular beacons)
- •Применение 2-х зондов с резонансным переносом энергии (LightCycler assay)
- •Сравнение методов sybr Green и TagMan
- •Материально-техническое обеспечение (Используемое оборудование и материалы для проведения пцр «в реальном времени»)
- •Основные этапы работ
- •Базовые параметры реакции
- •Базовый протокол TaqMan амплификации
- •Проведение полимеразной цепной реакции в реальном времени
- •Способ учета результатов
- •Анализ результатов
- •Пример протокола реакции для амплификатора Bio-Rad cfx 96
- •Пцр с обратной транскрипцией
- •Протокол проведения процедуры обратной транскрипции
- •Электрофорез днк
- •Методика заливки агарозного геля
- •Определение концентрации и качества днк/мРнк в агарозном геле
- •Полиморфизм длины рестрикционных фрагментов (пдрф-анализ)
- •5. Анализ конформационного п олиморфизма однонитевой днк (sscp-анализ)
- •6. Секвенирование
- •Порядок подготовки образцов днк к секвенированию.
- •1Мкл буфер BigDye
- •Современные методы полногеномного секвенирования днк
- •5. Метод биочипов
- •Основные технологии производства днк-микрочипов
- •Оценка экспрессии генов с помощью днк микрочипов (на примере Affymetrix GeneChip)
- •Полногеномное генотипирование полиморфных локусов с помощью микрочипов высокой плотности (на примере Illumina Human610-Quad BeadChip)
- •Список использованной литературы
- •Приготовление рективов для выделения днк Приготовление лизирующего буфера
- •Приготовление Трис-нСl 2 m (pH 7,6)
- •Приготовление 0,5 м эдта (рН 8,0)
- •Приготовление Soline (эдта)
- •Приготовление 5 м NaCl
- •Приготовление 10% sds (додецил сульфат натрия)
- •Приготовление фенола
- •Компоненты и реактивы для прведения электрофореза днк
- •Приготовление реактивов, неоходимых при проведении sscp-анализа
- •Триплетный генетический код
- •Биолоические базы данных
Приготовление реактивов, неоходимых при проведении sscp-анализа
Приготовление денатурирующей смеси для SSCP-анализа
Компонент |
Количество |
NaOH 5M |
10 мкл |
ЭДТА 0,5М |
10 мкл |
Н2О |
90 мкл |
Денатурирующую смесь готовят непосредственно перед раскапыванием в эппендорфы для смешивания с ПЦР-продуктом. Необходимо как можно быстрее раскапать смесь, так как через 30 минут после приготовления у денатурирующей смеси резко снижается активность.
Приготовление ПААГ для SSCP (на 50 мл)
10% гель |
8% гель |
||
Компонент |
Объем |
Компонент |
Объем |
30% акриламид 29:1 |
16,7 мл |
30% акриламид 29:1,3 |
13,3 мл |
10хТВЕ |
2,5 мл |
10хТВЕ |
2,5 мл |
50% глицерин |
5 мл |
50% глицерин |
5 мл |
ТЕМЕД |
50 мкл |
ТЕМЕД |
50 мкл |
10% ПСА |
443 мкл |
10% ПСА |
443 мкл |
Н2О |
до 50 мл |
Н2О |
до 50 мл |
Приложение 6
Триплетный генетический код
|
U |
C |
A |
G |
|
U |
Phe(F) Phe(F) Leu(L) Leu(L) |
Ser(S) Ser(S) Ser(S) Ser(S) |
Tyr(Y) Tyr(Y) Term Term |
Cys(C) Cys(C) Term Trp(W) |
U C A G |
C |
Leu(L) Leu(L) Leu(L) Leu(L) |
Pro(P) Pro(P) Pro(P) Pro(P) |
His(H) His(H) Gln(Q) Gln(Q) |
Arg(R) Arg(R) Arg(R) Arg(R) |
U C A G |
A |
Ile(I) Ile(I) Ile(I) Met(M) |
Thr(T) Thr(T) Thr(T) Thr(T) |
Asn(N) Asn(N) Lys(K) Lys(K) |
Ser(S) Ser(S) Arg(R) Arg(R) |
U C A G |
G |
Val(V) Val(V) Val(V) Val(V) |
Ala(A) Ala(A) Ala(A) Ala(A) |
Asp(D) Asp(D) Glu(E) Glu(E) |
Gly(G) Gly(G) Gly(G) Gly(G) |
U C A G |
Приложение 7
Биолоические базы данных
База данных |
Интернет-сайт |
Исследования |
GenBank |
www.ncbi.nlm.nih.gov/genebank |
нуклеотидные последовательности |
GeneCards |
http://www.genecards.org/ |
гены человека |
PubMed |
www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed |
Научные |
Entrez Protein |
www.ncbi.nlm.nih.gov/protein |
последовательности белков |
SWISS-PROT |
web.expasy.org/groups/swissprot |
последовательности белков |
InterPro |
www.ebi.ac.uk |
белковые домены |
OMIM |
www.ncbi.nlm.nih.gov/omim/ |
наследственные заболевания |
Pfam |
www.pfam.sanger.ac.uk |
семейства белков |
PDB |
www.rcsb.org/pdb |
структуры белков |
KEGG |
www.kegg.jp |
метаболические пути |
[Мухачева, 2012].
Интернет-сайты для поиска научной литературы:
www.pubmed.gov
www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc
www.sciencedirect.com
www.scopus.com
www.elibrary.ru
http://scholar.google.ru/schhp?hl=ru
www.molbiol.ru